3D生物打印脱细胞基质水凝胶的研究

　　细胞生物学课程论文（优选范文8篇）之第七篇

　　摘要：细胞外基质(ECM)包含复杂的蛋白质环境和多种生长因子,为细胞提供机械、生物物理和生物化学信号,具有组织器官特异性。器官衍生的脱细胞ECM(dECM)是目前最具仿生生物学的材料,这一特点使其在3D生物打印应用中成为热门材料。笔者总结了dECM水凝胶生物墨水的制备及其基本打印参数;回顾了衍生自不同器官的dECM水凝胶生物墨水的应用,并概括了用于评估这些生物墨水质量的表征方法;得到了制作优质的生物墨水取决于衍生的组织器官、动物和脱细胞方法的选择这一结论。最后,探讨了dECM水凝胶生物墨水的潜在大规模应用以及制造此类生物材料的挑战。

　　关键词：3D打印,生物墨水,细胞生物学,水凝胶,组织工程

　　3D生物打印是增材制造技术的重要形式,它通过计算机辅助将生物材料、生物因子和细胞在空间上逐层精确定位组装,并按需构建个性化的宏观及微观结构。现已被运用于组织工程学、再生医学、药代动力学和其他生物研究中活组织和器官的重建[1]。 生物墨水是3D生物打印中的一个重要组成部分,它与活细胞共同打印出。其中,挤出式3D生物打印的理想生物墨水应该具备以下特性:①具有良好的可打性:即有促进挤出的剪切稀化特性,有保证绘制形状的快速剪切恢复特性。②打印的支架具有良好的机械性能:即有长期且稳定的结构保真度,易于操作和处理。③具有良好的生物相容性,无毒性,不会引起免疫反应。④具有良好的生物降解性。⑤能够通过细胞友好的处理方法完全固化。⑥能够模拟特定细胞类型的体内微环境。⑦能够支持和促进细胞活动,如黏附、迁移、增殖和分化。天然衍生的水凝胶常用于3D生物打印[2,3,4],但天然材料制成的生物墨水黏度较低,打印的支架不能直接植入和重建承重组织。 相比之下,基于合成材料所打印的支架,例如聚己内酯(PCL)[5,6,7]、聚乙二醇(PEG)[8]和聚乳酸(PLA)[9]等,则具有更高的机械强度。 天然ECM含有各种蛋白质,提供细胞与ECM相互作用的结构。由于天然ECM的复杂性,使用一种或多种组分的生物墨水仍不足以完全包含天然ECM的特征,近年来新兴起的脱细胞基质(dECM)水凝胶可提供与亲本组织相似的微环境,供细胞生长。目前已开发出不同组织来源的dECM水凝胶,但与其他天然衍生材料生物墨水一样,dECM制备的生物墨水机械强度较低,因此需要合成材料的支撑以制造承重支架。

　　1 脱细胞基质水凝胶生物墨水的制备

　　ECM为细胞的生长发育提供微环境,其组分中的透明质酸、纤维蛋白和胶原蛋白等,均可用作生物墨水进行3D生物打印,其与活细胞的相互作用已在体外和体内得到充分研究[10]。为了创造与天然组织尽可能相似的微环境,开发了目前最具仿生生物学的聚合物——基于脱细胞外基质(dECM)的水凝胶。

　　目前针对脱细胞组织或器官的应用主要包括器官移植、外科重建和再生医学[11],对于此类应用,最重要的是保留ECM的组分及其天然超微结构,因此,需要制备dECM水凝胶所使用的化学、物理和酶促等方法在去除细胞的同时不损害或损失ECM,脱细胞的主要方法有:①化学,包括酸和碱、洗涤剂、低渗和高渗溶液、醇和溶剂。②生物,包括酶、核酸酶和螯合剂。③物理,包括温度、压力、电穿孔和力的直接影响。④上述两者或三者的组合[12,13,14]。其中,脱细胞剂应用于器官或组织的方法有4种:灌注脱细胞、压力梯度、超临界流体、浸泡和搅拌[12]。脱细胞方法的选择至关重要,不同的方法会影响ECM的构成和比例,进而影响dECM生物墨水对再生医学的效力。

　　脱细胞处理完成后的组织块需要冻干并研磨成粉,将dECM粉末进一步溶解至所需浓度,调节PH形成具有可打印性的凝胶流体状物质。灭菌为dECM生物墨水制备过程的最后一步。可选用4%乙醇或0.1%过乙酸[15]进行灭菌,也可以通过0.22 mm的过滤器进行灭菌[17]。对高黏度的生物墨水,可以使用替代方法例如超临界二氧化碳[15]、环氧乙烷气体[16]等进行灭菌处理。

　　2 dECM水凝胶生物墨水的基本打印参数

　　2.1 黏度和黏弹性

　　生物打印的最佳黏度主要取决于成胶速度和打印速度。具有剪切稀化特征的生物墨水,在维持高分辨率打印的同时可以保护生物墨水中的细胞。由Pati等[7]开发的剪切稀化dECM水凝胶表现出2.8 Pa/s(软骨衍生的dECM)至23.6 Pa/s(心脏衍生的dECM)的黏度。

　　2.2 存储模量和损耗模量

　　存储模量应高于损耗模量,以保证凝胶化后可维持支架形状。Pati等[7]的研究表明,存储模量越高,黏弹性越大,打印的结构越精细。不同组织衍生的dECM具有不同的机械性能, Pati等[7]的实验证明与脂肪或心脏组织所衍生的dECM水凝胶相比,软骨衍生的dECM水凝胶具有更高的存储模量

　　2.3 喷嘴直径

　　喷嘴直径影响打印结构的精细度。喷嘴越细,打印结构的精细度越高。但对打印性较差的生物墨水使用较细的喷嘴时,则会有堵塞的可能,因此,需要在打印结构的精细度和生物墨水的可打印性之间取得平衡。Jang等[17]在研究各打印参数中发现,喷嘴直径对打印线条的宽度影响最大。

　　3 脱细胞基质水凝胶生物墨水的应用

　　dECM水凝胶已经用于微创输送,其中预凝胶黏性流体可以通过导管或注射器注射到患者体内,操作快捷简便。其中预凝胶流体在体温下易聚合成水凝胶,适应任何缺损的形状[6]。最新的基于ECM的水凝胶可从各种器官发展而来,包括肺[18]、肾[19]和胰腺[20]等,这些也可以制作成生物墨水进行3D生物打印。目前dECM水凝胶生物墨水主要应用于以下几个方面。

　　3.1 软骨

　　修复软骨的支架应具备良好的机械性能,然而脱细胞化过程对机械强度影响明显,所制得的支架压缩强度低。Pati等[7]结合软骨dECM和聚己内酯构建了具有稳定且较高机械强度的软骨结构。 Beck等[21]的研究则开发了一种甲基丙烯酸酯化脱细胞软骨凝胶,其压缩模量可接近天然关节软骨(1 070±150)kPa。

　　3.2 骨骼肌肉组织

　　Choi等[22]使用基于猪骨骼肌的脱细胞基质(mdECM)水凝胶培养成肌细胞,后者融合成多核肌管,这是肌原性分化的标志。 同时,与胶原蛋白相比,成肌细胞在mdECM水凝胶中培养时,分化标志物显示出更多的肌原性基因表达上调。

　　3.3 肝脏

　　Skardal等[23]将具有各种分子量、官能团和几何形状的PEG交联剂与肝脏dECM组合,产生具有所需剪切刚度值的水凝胶生物墨水。 为了分析生物打印的肝脏构建体的功能,在水凝胶预凝液中加入原代人肝脏球体,打印的肝脏组织构建体产生可用作检测指标的白蛋白和尿素。这种生物墨水系统不仅可以将原生dECM水凝胶打印出来,还可以通过肝脏ECM的蛋白质组学阵列对生长因子和细胞因子进行系统的分析。

　　3.4 脂肪

　　Pati等[7]用PCL作为支持材料,打印脱细胞脂肪组织(DAT)生物墨水形成支架。 该混合支架包封人类皮下脂肪干细胞(hASC)后,形成的组织构件体植入小鼠皮下以评估功能性。植入后在管腔中发现了红细胞,表明组织构建体在小鼠皮下显示出有效的血管生成反应。苏木精和伊红(H&E)染色表明炎症细胞已渗入组织构建体的外周,表明宿主组织中存在动态重塑。

　　3.5 血管组织

　　Gao等[24]使用含有海藻酸盐和血管组织衍生的dECM混合生物墨水开发并打印出了生物血管(BBV)。 除了脱细胞化的血管组织外,混合生物墨水还含有负载内皮祖细胞和阿托伐他汀(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)的聚微球。 生物打印的同轴方法也被用于以管状方式打印BBV,使得能够在中央空间中进行最终的血液灌注。 BBV和药物的组合在缺血小鼠模型中增加了新血管形成密度,验证了其潜力。 这是第一项证明在印刷过程中使用dECM水凝胶生物墨水作为药物载体的研究。

　　3.6 皮肤

　　Ahn等[25]使用猪皮衍生的生物墨水打印了含有细胞的支架。此支架保留了天然皮肤组织中的所有胶原蛋白。同时,为了克服打印dECM水凝胶的相关问题,如液体状流变学和不适当的交联,通过修改生物打印机形成了新的3D细胞打印系统——此打印机包含了两个加热系统(上部和下部),以确保了打印出的生物墨水同时凝胶化。实验证明此打印模式优于作为对照组的非加热模式,打印的含细胞的3D构建体具有高保真度和高细胞活力。

　　3.7 角膜

　　Kim等[26]将人鼻甲来源的间充质干细胞包封在衍生于角膜的dECM水凝胶中进行生物打印,发现干细胞仅在角膜dECM水凝胶中分化为核细胞。且所开发的角膜dECM水凝胶中胶原蛋白和GAG与天然组织具有相似的定量测量结果。

　　目前为止,已研制出各种组织特异性dECM水凝胶生物墨水,并且已经用相关细胞证明了它们可制造出组织构建体。必要时,可通过混合和(或)与合成或天然交联剂交联的方法,提高dECM水凝胶生物墨水的仿生效果。

　　综上所述, 3D生物打印技术的发展,为组织工程带来了新方向。生物墨水是生物打印的基本组成部分,是打印组织结构进一步完善的重要基础。从器官或组织本身提取出来的dECM水凝胶生物墨水是目前最符合仿生学要求的材料,具有良好的应用前景。部分来自不同器官组织衍生的dECM水凝胶生物墨水所打印出支架的功能特征已经得到验证,其他组织器官衍生的dECM水凝胶生物墨水也在研发中,随着制备参数及打印参数逐渐成熟,所打印支架的形态及性能也逐渐完善。到目前为止,大多数dECM水凝胶生物墨水的来源是猪组织,因此,需要进一步证实这类材料的生物可接受性。 同时,对此类生物墨水的制备方法尚未达成统一共识,如何制作出更高的质量、产量,以及相关的免疫学问题,是dECM水凝胶生物墨水面临的重要挑战。 其余的问题主要包括:不同生产批次间的dECM水凝胶生物墨水,其脱细胞效果存在差异;此类生物墨水的机械强度较差,降解较快;对此类生物墨水的灭菌处理的方法及其效果有待进一步研究。 dECM水凝胶生物墨水的开发和应用还面临着诸多困难,考虑到打印组织构建体的支架和细胞需求,制备改良型dECM水凝胶生物墨水应该是未来发展的焦点。

　　参考文献
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