基于免疫学分析CD4分子在牦牛淋巴器官的表达

　　牦牛（Bos grunniens）是青藏高原土着动物的典型代表之一，素有“高原之舟”之美誉。青藏高原是世界上平均海拔最高，面积最大的高原，高寒、缺氧及强辐射是高原地区主要应激因子，应对这些生态压力，牦牛机体免疫和健康状况发挥至关重要的作用。流行病学调查表明，牦牛疫病主要为细菌性传染病和寄生虫病，呈散发性发生，治疗后未形成流行（姬秋梅， 2001; 姚金桂， 2011; 殷铭阳等， 2014）。

　　由此可见，牦牛具有较好的抗寒抗病能力，因此对其免疫器官研究具有特殊的意义和价值。但由于牦牛分布地域的限制，现场采样较困难，目前关于牦牛免疫系统尤其是相关免疫活性分子及细胞的研究报道较少（张倩等， 2013; 康新华等， 2014）。

　　机体免疫系统主要保护健康细胞免受以下两个威胁：感染和创伤。T细胞是适应性免疫系统的成员细胞，被激活之后通过诱导级联反应分泌促炎细胞因子和细胞毒性分子和/或通过直接的细胞介导的毒性作用，清除病毒感染细胞、癌细胞和其他病原体。胸腺为机体中枢免疫器官，是培育T淋巴细胞的“苗圃”（Pearse, 2006）。脾、淋巴结及血结属周围淋巴器官，是引起免疫应答的重要场所（Luscieti et al., 1980; 王 世 英 等， 1992; 沈 元 新，1997; Cesta, 2006）。值得一提的是，血结作为反刍动物免疫系统内的一种独立淋巴器官，其免疫功能常被免疫学家所忽视。研究表明，牦牛血结组织结构与淋巴结、脾相似 （董曼霭， 张爱琴， 1989），然而，牦牛血结在免疫活动中的作用尚不明确。这提示可以通过比较牦牛血结与其他免疫器官内的免疫活性分子及细胞的数量与分布，初步探索牦牛血结的免疫功能。

　　哺乳动物的 CD4 分子是辅助性 T 淋巴细胞（Th）重要的表面标志，其是一种跨膜糖蛋白（Litt-man, 1987），广泛参与 T 细胞受体对主要组织相容性复合物Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）分子递呈抗原的识别和信号传递 （Leahy,1995）。CD4+T 细胞通过分泌细胞因子和趋化因子激活和（或）招募靶细胞，在细胞免疫反应中发挥重要的生物学功能（Abbas et al., 1996; Romagnani,1996; Zhu et al., 2008 ），主要包括：（1）抵御胞内病原微生物感染；（2）抵御胞外持续存在的蠕虫、线虫等寄生虫感染；（3）参与某些自身免疫病、移植排斥反应、急性及慢性炎症性疾病等免疫病理过程发生、发展（Park et al., 2005）。此外，CD4+T 淋巴细胞在清除癌变组织/细胞过程中也有重要意义 （Wiederet al., 2005; Greenberg et al., 1985; Kamiryo et al.,2009 ）；此外，CD4+T 淋巴细胞具有不依赖 CD8+T淋 巴 细 胞 的 肿 瘤 杀 伤 效 果 （Perez- Diez et al.,2007）。因此，以 CD4+T 淋巴细胞为主的 T 淋巴细胞亚群分布及数量的基础研究，对于临床各类疾病的诊断、治疗监测、发病机制、药理作用机制等方面至关重要。目前，有关 CD4 分子在免疫器官的数量及分布研究主要集中在牛（Bos taurus） （Bensaidet al., 1991; Zhang et al., 2012）、羊 （Ovis aries）（Thorp et al., 1991）、兔 （Oryctolagus cuniculus） （Jek-lova et al., 2007）、猫 （Felis catus） （Bortnick et al.,1999）等动物，有关牦牛 CD4 分子研究未见报道。

　　本研究采用RT-PCR法克隆牦牛 CD4 的基因序列，通过实时荧光定量PCR、Western blot及免疫组织化学 SABC 法检测健康成年牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结内CD4 mRNA及蛋白的数量及分布，初步了解 CD4 分子在机体特异性免疫应答的作用机理，为进一步探索牦牛免疫遗传学和免疫生物学等相关研究提供基础资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　采集3岁成年健康雄性牦牛（Bos grunniens）胸腺、脾及分布于空肠的肠系膜淋巴结和血结，各5头份，取自青海西宁屠宰场。

　　1.2 方法

　　1.2.1 样品采集与准备

　　采集的牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结，部分放入4%中性多聚甲醛固定，用于石蜡切片进行免疫组化检测。部分迅速放入液氮中过夜，次日移至-80 ℃超低温冰箱保存，以备提取组织 RNA 和蛋白质。

　　1.2.2 引物设计与合成

　　根据 GenBank 登录的黄牛（Bos taurus,NM_001103225.1）、绵羊 （Ovis aries,NM_001129902.1）、山羊（Capra hircus,EU913093.1）、白鲸（Delphinapterus leucas,AF071799）、海豚（Tursiops truncatus,NM_001280654.1）基因序列，采用 Primer Premier 5.0 软件，设计牦牛CD4基因测序引物（yak CD4）；根据测序 所 得 牦 牛 CD4（KP030826） 和 牦 牛 β- actin（DQ838049）基因序列，用 Primer Premier 5.0 软件设计实时定量PCR引物，由TaKaRa公司合成（表1），序列分析使用 NCBI 在线软件、MEGA5 和 DNA-man 软件。

　　1.2.3 mRNA 提取、反转录 cDNA 及 PCR 扩增

　　按照TRIzol （Invitrogen, 美国）总RNA 提取试剂盒说明书提取各实验组织总RNA.根据反转录试剂盒（Invitrogen）说明将RNA反转录成cDNA.PCR反应体系为20μL:模板（400 ng/μL） 1μL,上下游引物（0.2μmol/mL）各 0.5μL,Taq PCR Master Mix 10μL,无菌去离子水 8μL. 反应结束后取 10μL PCR产物，用1 %琼脂糖凝胶电泳（150 V 20 min）检测；凝胶成像系统采集图像。DNA胶回收试剂盒（Omega）纯化PCR产物片段，送华大基因测序。

　　1.2.4 实时定量 PCR 检测

　　使用罗氏480实时定量PCR仪进行实时定量PCR 检测。实时定量 PCR 反应体系：10μL SYBRPremax Tag （TaKaRa）、上、下游引物各 0.5μL、1μL cDNA 样品和 8μL 灭菌超纯水。实时定量PCR 反应程序：95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性 10 s,62 ℃分别退火 10 s,72 ℃延伸 15 s,共 45 个循环；95 ℃ 5 s,65 ℃ 1 min,40 ℃ 30 s.每个循环的退火及延伸阶段采集荧光信号数据。扩增结束后根据溶解曲线报告判断反应的特异性。为保证样品中目的基因相对表达量的准确性，每管样品设3个重复。 采样相对定量分析法分析基因表达（Pfaffl etal., 2002）。实验数据用 Excel 整理后利用 SPSS21.0 软件进行方差分析，采用 Duncan 法进行均值的多重比较。

　　1.2.5 组织中CD4蛋白表达水平的Western blot检测

　　液氮保存的胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结等组织，进一步在液氮中研磨后，按 1 mL RIPA+10μL 苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）（100 mmol/L） （Solarbio）的比例加入 RIPA 和PMSF（ 先 加 RIPA 再 加 PMSF），匀 浆 约 30 min.4 ℃ 1 200 ×g离心 5 min,收集上清，调整蛋白浓度，按比例加入4×SDS上样缓冲液（Solarbio），沸水煮约10 min,使蛋白变性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为10μL,当蛋白跑至分离胶，电压由80 V切换为100 V直至电泳结束。用300 mA 的电流在4 ℃冰箱内电泳1~2 h,将蛋白转至PVDF（Solarbio）膜。再以 5 %脱脂牛奶封 2 h,分别加入一抗小鼠Anti-CD4 （1/200） （MCA834GA, AbD Se-rotec） 及小鼠 Anti-Actin （I-19, Santa Cruz） 4 ℃过夜孵育，PBS洗后分别加入二抗山羊抗小鼠（sp-0024,Bioss），37 ℃孵育 2 h.加入 ECL 曝光液（碧云天）显色5~10 min左右观察结果，以β-actin 为对照。通过ImageJ 软件分析 WB 条带表达量。