黑蒜提取液对荷H22小鼠移植瘤抗血管生成作用

　　中医药的抗肿瘤作用受到国际广泛关注，得到极大认可，成为肿瘤研究的新热点和方向。黑蒜有广泛的抗菌、杀菌、抗病毒作用，可以增强人体免疫力，用来防止免疫反应的风险。因为它能刺激淋巴细胞、巨噬细胞，抑制肿瘤细胞的扩散，对预防肿瘤及对抗肿瘤生长有着积极的作用。本研究以荷 H22 小鼠为实验对象，研究黑蒜提取液对荷 H22 小鼠移植瘤抗血管生成作用，为临床应用提供理论依据。

　　1、 材料与方法

　　1.1 细胞系、试剂及仪器：黑蒜提取液：中国人民解放军第 107 医院实验中心采用大连华谷蒜业有限公司生产的黑蒜制备成相当于生药 1g/mL 黑蒜提取液；DMEM 高糖培养基：Hyclone 公司；已灭活胎牛血清：Hyclone 公司；胰蛋白酶（trypsin）：Amersco 公司；DMSO：安徽安特化工有限公司；MVD：Boosen 生物科技有限公司；VEGF：武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 实验动物和细胞系：C57BL/6 小鼠 40 只，6～8 周龄，雄性，18～21g，购于北京协和医科大学实验动物中心，SPF 级饲养环境饲养。小鼠肝癌 H22 细胞系滨州医学院实验中心惠赠，小鼠腹腔传代。

　　1.3 动物造模：小鼠 H22 细胞腹腔传代 4 次后，抽取小鼠腹水，PBS洗涤 3 次，以 1000r/min 离心 4min。0.4%苔盼蓝拒染法检测细胞存活率，存活率高于 90%条件下以 PBS 调整细胞浓度为 1×105个/ml，以 0.2ml/只接种于小鼠背部。

　　2、 实验方法

　　2.1 实验分组及处理：待小鼠皮下接种肿瘤直径达 8～10mm 后随机分为 4 组。阴性对照组：腹腔注射 0.9% NaCl 0.2ml/次，连续 14d。黑蒜提取液低剂量组（20mg/ml）、黑蒜提取液中剂量组（50mg/ml）、黑蒜提取液高剂量组（100mg/ml）腹腔注射黑蒜提取液 0.2ml/只，连续14d。

　　2.2 免疫组织化学法检测 MVD、VEGF 蛋白表达：取等量小鼠瘤体然后放入 4%的多聚甲醛固定液中固定后，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、作 4μm 切片，选用 bcl-2、bax 单克隆抗体，应用SABC 法对小鼠瘤体组织进行免疫组织化学染色，MVD、VEGF 抗体浓度分别为 1∶150、1∶250，AEC 显色，苏木素轻度复染，封片。将所染免疫组化切片置于 OLYMPUS BX51（FN 22）高倍镜（×40）下观察，每张片取 5 个视野，实验重复 3 次。

　　2.3 统计学方法：用 SPSS 13.0 for windows 统计学软件处理。检测数据以均数±标准差（x±s）表示，计数资料采用 X2检验，计量资料采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

　　3、 结 果

　　MVD、VEGF 蛋白表达：阴性对照组、黑蒜提取液低剂量组、黑蒜提取液中剂量组、黑蒜提取液高剂量组 MVD 分别为（9.7±0.6）、（8.6±0.7）、（6.9±0.9）、（4.4±0.7），VEGF 分别为（67.3±12.3）、（59.4±11.8）、（40.5±10.2）、（31.2±9.3）。

　　4、 讨 论

　　肝细胞癌是最常见的临床恶性肿瘤之一，每年全世界有超过六十万个新的 HCC 患者，为排名第五的恶性肿瘤。肝细胞癌发病隐匿，发展迅速，高度恶性，容易转移。中医治疗可以减轻症状，减少患者的痛苦，提高生活质量。中医和中药提取物能促进肿瘤细胞凋亡、提高免疫力，改变肿瘤生长的微环境，达到抑制肿瘤生长的目的。

　　肝癌是一种血管生成依赖性肿瘤，其增长、入侵和转移需要血管生成。显微肿瘤微血管密度可以直接反映肿瘤血管生成的程度，许多恶性肿瘤组织中 MVD 明显更高，这是一个独立的预后因子评估后淋巴结转移。血管内皮生长因子（VEGF）对血管内皮细胞的影响是最强的，最特殊的生长因子。VEGF 在肿瘤血管生成中起着重要的作用。这项研究的结果发现，EABG 可以显著抑制移植瘤的生长，减少肿瘤组织 MVD 和 VEGF 的表达。结果表明:EABG 能明显抑制 H22 移植瘤 MVD 和 VEGF 的表达发挥抗血管生成的作用。

　　参考文献：
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