探讨有氧运动改善海马组织氧化应激水平的机制

　　近年来，老年人学习记忆能力减退相关疾病的发生率逐年上升，已引起了国内外的广泛关注。

　　Floyd 等研究发现，活性氧自由基( reactive oxygenspecies，ROS) 的增加与衰老的进程及老龄化过程中认知功能的退化密切相关。大量研究结果已经证实，长期适宜强度运动可以降低氧化应激相关疾病的危险性，且可以抵抗老龄化导致的认知功能减退，这一现象在人及动物模型中已经得到广泛验证。尽管有氧运动改善脑组织氧化应激水平进而改善认知功能的现象不断得到证实，但有氧运动改善脑组织氧化应激水平的确切机制仍然没有完全阐明。过氧化物酶体增殖活化受体 γ 辅助活化因子1α( Peroxisome proliferator － activated receptor gammacoactivator 1 － alpha，PGC － 1α) 是 ROS 新陈代谢的重要调解因子，而 AMP 激活蛋白激酶( AMP － acti-vated protein kinase，AMPK) 则是调解 PGC － 1α 磷酸化的一种蛋白激酶，其表达变化可对 PGC －1α 表达产生重要影响。在肌肉组织内，AMPK 及 PGC －1α表达的变化对改善肌肉组织氧化应激水平具有重要调控作用。但在脑组织内，有氧运动是否通过改善以上蛋白表达而达到了改善氧化应激水平的目的，目前尚未见到相关报道。为此，研究对 8 周有氧运动老年大鼠海马 ROS 水平、抗氧化物酶活性( 超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶( glutathione peroxidase，GPx) ) 、脂质过氧化产物( 丙二醛，malondialdehyde，MDA) 、PGC－ 1α 及 AMPK 表达水平进行了检测，旨在探讨有氧运动改善海马组织氧化应激水平的机制，进而为揭示有氧运动抵抗老龄人口认知功能减退的相关机制提供实验依据和数据支持。

　　1 材料与方法

　　1． 1 实验动物及分组
　　实验选用鼠龄为 24 月的健康雄性 Wistar 大鼠，体质量为( 340 ±20) g，常规分笼饲养，自由进食饮水，自然光照，动物房内温度( 20 ± 3) ℃，相对湿度为 40% ～ 60%。动物随机分为空白对照组( CG) 、运动组( EG) ，每组 8 只，共 16 只。

　　1． 2 大鼠有氧运动方案
　　运动组大鼠先进行一周的适应性跑台训练( 隔天 1 次，共 3 次) ，速度 10 m/min，每次 15 min。适应性训练后，未见不良反应的大鼠于 24 h 后进行正式实验。大鼠有氧运动方案采用修改后的 Bedford递增负荷跑台运动方案。运动组大鼠共进行8 周有氧跑台训练，每周 5 次，训练均安排在每周的周一至周五晚间进行，运动负荷如表 1 所示。

　　1． 3 样本的制备
　　最后一次运动 24 h 后，用 2% 戊巴比妥钠( 3mL / kg) 腹腔麻醉大鼠，断头取脑，冰玻片上迅速剥离出两侧海马，－80 ℃冰箱保存待测。1． 4 ROS、SOD、GPx 及 MDA 含量的测定采用化学荧光法对大鼠海马 ROS 含量进行测定。取大鼠海马 0． 1 g，按质量( g) ∶ 体积( mL) =1∶ 20 的比例加入匀浆介质 ( 100 mmol / L 磷酸缓冲液) ，冰水浴条件下机械匀浆，1 000 g 离心 10 min，取部分上清采用考马斯亮蓝法对其进行蛋白定量检测( A045 －2 试剂盒，南京建成) 。另取匀浆上清液加入荧光探针( E004，南京建成) ，37 ℃孵育30 min，对其荧光强度进行测定( 激发波长 500 nm，发射波长 525 nm) ，测定结果以荧光强度/毫克蛋白表示。

　　大鼠海马 SOD、GPx 及 MDA 的含量采用相应试剂盒进行检测( 南京建成) ，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。【表1】

　　
　　1． 5 PGC － 1α 及 AMPK 的测定大鼠海马 PGC －1α 及 AMPK 的测定
　　采用 west-ern blot 方法进行，实验过程如下: 取适量海马匀浆处理后加入裂解液( 包含 137 mM Nacl，20 mM Tris－ HCl pH 8． 0，2% Nonidet P － 40，10% 甘油及蛋白酶抑制因子) ，将其超声处理 30 s 后，4 ℃环境下 15300 g 离心 15 min，收集上清，采用 BCA 蛋白定量方法测定总蛋白浓度，分装，于 － 80 ℃保存待测。取20 μg 蛋白进行 SDS － PAGE 凝胶电脉( 8 ～ 12% ，V /V) ，PVDF 膜转印，5% 脱脂奶粉封闭 ( 室温，2 h) 。

　　加入经过 TBS － T 缓冲液稀释的一抗( PGC － 1α，1∶ 1 000，货号 13067，Santa Cruz Biotechnology，美国;AMPK，1∶ 2 000，货号 2532，Cell Signaling Technolo-gy，美国) ，4 ℃ 过夜后，将膜放入 TBS － T 缓冲液进行冲洗，加入 HRP 标记二抗，室温孵育 1 h，TBS － T缓冲液中反复冲洗之后，与增强化学发光剂孵育。

　　在暗室中使用 X 胶片曝光，显影，定影后观察结果。使用 Quantity one ( Bio － Rad) 软件对目的蛋白和内参蛋白进行光密度分析，以 actin 蛋白为内参。目的蛋白相对含量 = 目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

　　1． 6 统计学处理
　　所得数据均用平均数标准差( x ± s) 表示，利用SPSS10． 0 对所有数据进行处理并进行独立样本 T检验，P ＜ 0． 05 表示差异显着。
　　
　　2 研究结果
　　
　　2． 1 不同组别大鼠海马 ROS 含量的比较
　　如图 1 所示，8 周有氧运动训练使大鼠海马ROS 含量较对照组显着降低( P ＜ 0． 05，相对浓度分别为 0． 69 ±0． 03 和 0． 39 ±0． 02) ，提示有氧运动训练可显着减少海马活性氧自由基水平。【图1】

　　
　　2． 2 不同组别大鼠海马 SOD 及 GPx 活性的比较
　　实验结果发现( 见图 2 － A 及图 2 － B) ，运动训练组大鼠海马 SOD 及 GPx 活性较对照组均显着上升( P ＜ 0． 05) ，运动组与对照组 SOD 活性分别为( 88． 07 ± 7． 46) U/mgprot 及( 105． 03 ± 15． 17) U/mgprot; GPx 活性分别为( 2． 83 ± 0． 42) U / mg prot 及( 4． 37 ±0． 73) U/mg prot) 。【图2】

　　2． 3 不同组别大鼠海马 MDA 含量的比较
　　实验结果发现( 见图 3) ，对照组大鼠海马 MDA含量为( 3． 09 ±0． 41) U/mgprot，而运动训练组含量为( 1． 51 ±0． 34) U/mgprot，两组间呈现差异显着( P＜ 0． 05) ，提示长期有氧运动训练可显着降低海马脂质过氧化损伤水平。【图3】

　　2． 4 不同组别大鼠海马 PGC － 1α 表达的比较
　　如图 4 所示，对照组海马 PGC －1α 表达水平为0． 64 ± 0． 19，与对照组相比，运动组海马 PGC － 1α表达显着升高( 1． 18 ±0． 29，P ＜0． 05) 。【图4】

　　2． 5 不同组别大鼠海马 AMPK 表达的比较
　　实验结果显示( 见图 5) ，运动组海马 AMPK 含量为 2． 1 ±0． 37，与对照组相比( 1． 64 ± 0． 29) 显着升高( P ＜0． 05) 。提示有氧运动训练可显着增加海马 AMPK 表达水平。3 分析与讨论海马是与认知功能高度相关的脑区之一，研究对 8 周有氧运动训练后大鼠海马氧化应激水平进行了观察，发现运动组大鼠海马 ROS 含量及反应脂质过氧化水平的 MDA 含量显着降低( P ＜ 0． 05，见图1、图 3) ，而反映脑组织抗氧化水平的 SOD、GPx 活性显着升高( P ＜ 0． 05，见图 2) 。已知体内 ROS 清除的第一道防线是由抗氧化剂的酶促作用组成的，首先在 SOD 的作用下，ROS 转化为过氧化氢，过氧化氢再在 GPx 和/或过氧化氢酶的作用下被清除，由于脑内过氧化氢酶的含量非常低，因此，脑组织中过氧化氢的清除主要依靠 GPx 来完成。随着年龄的增长，第一道防线的抗氧化能力逐渐降低，又由于老龄化过程中，海马对氧化损伤的敏感性增加，因此，老龄化过程中海马极易受到氧化损伤，只能通过降低神经容量来维持氧化还原的内环境稳态，神经容量的减少影响到学习记忆的能力，继而导致认知功能的损害。而长期有氧运动训练后，随着 SOD、GPx 活性的升高，其抗氧化能力得到增强，氧化应激相关疾病的危险性降低，继而使老龄化导致的认知功能减退得以缓解，这一途径可能是运动训练预防老龄化过程中认知功能减退的重要机制之一。以往研究证实，不同的运动强度对不同组织氧化还原状态的调节幅度不同。Radak 等研究发现: 一次力竭运动和重复力竭运动会增加肌肉和肝脏中 ROS 的含量和氧化损伤，而适宜强度的规律性运动则会降低大鼠脑内氧化应激水平，这一结果提示，运动训练过程中训练的强度和训练量是关键，否则不仅不会起到有益作用，反而会适得其反，加重老龄化过程中认知功能障碍等神经系统退行性疾病的程度。【图5】

　　
　　长期有氧运动训练可改善大鼠海马氧化应激水 平，这一现象在以往研究中已经有少量报道。本研究除进一步证实该过程外，还对运动训练改善其氧化应激水平的深层机制进行了初步探索。PGC －1α 是神经细胞氧化还原平衡的调节因子，是诱导SOD － 1、SOD － 2 和 GPx 等抗氧化酶基因表达的必要因素，PGC －1α 表达的上调可以缓解神经元由于氧化应激介导的细胞死亡，在防止神经变性过程中发挥作用。因此，PGC － 1α 被认为是调解 ROS新陈代谢重要调解因子之一。除此之外，PGC － 1α还可作用于与调控线粒体电子传递活动有关的转录因子，影响线粒体的功能，进而影响能量代谢。

　　Koltai 等研究结果显示，运动训练可以提高老年大鼠肌肉 PGC －1α 的蛋白表达。Steiner 等研究结果显示，8 周运动训练可导致特定脑区 PGC － 1αmRNA 表达的上调。然而，有关长期有氧运动对老年大鼠海马 PGC －1α 表达影响的研究至今尚未见到相关报道。本研究结果发现，长时间有氧运动可以提高老年大鼠海马中 PGC －1α 蛋白表达的水平，该途径可能是导致海马 SOD、GPx 活性上升，ROS、MDA 含量下降，进而使海马氧化应激水平得以改善的机制之一。

　　AMPK 作为调解 PGC － 1α 磷酸化的一种蛋白激酶，其表达变化可对 PGC － 1α 表达产生重要影响。Yu 等研究发现，药物刺激 AMPK 可以促进视觉皮层神经元 PGC － 1α 的转录激活。Jager 等研究结果显示，骨骼肌 AMPK 的激活可介导 PGC －1α 的表达。因此，探讨长期有氧运动对大鼠海马AMPK 表达的影响对于理解 PGC － 1α 及下游 SOD、GPx 活性变化具有重要意义。本研究结果显示，长时间有氧运动使大鼠海马 AMPK 蛋白表达增加。

　　笔者推测，运动对 AMPK 表达变化的影响可能是通过钙调节蛋白依赖性激酶( Calmodulin － dependentkinase，CaMKK) 及氧化还原状态变化介导的。已知CaMKK 是调节 AMPK 表达变化的上游调节因子之一，Hescham 等研究报道，运动可导致 CaMKK 的变化，继而可能介导 AMPK 表达的上调。除此之外，运动过程中产生的 ROS 及运动造成的脑组织适度缺氧也会诱导 CaMKK 及 AMPK 表达的增加。

　　基于以上研究结果，AMPK 激活可能是运动作用于海马的一个关键目标分子，通过调控 AMPK 来调节PGC － 1α，进而来调节 SOD、GPx 活性，起到改善氧化应激水平的目的。

　　4 结 论

　　( 1) 长时间有氧运动可以降低老龄化大鼠海马的 ROS 水平，减少脂质过氧化损伤，提高抗氧化酶水平。( 2) 有氧运动可以有效的调节氧化还原平衡状态，延缓氧化应激引起的神经变性进程。( 3)AMPK 的激活，PGC － 1α 蛋白表达的增加，可能是改善海马内氧化还原平衡状态的分子途径。