冬泳对大鼠解偶联蛋白UCP基因表达的作用

　　冬泳运动是利用机体可接受的冷刺激量来激发各系统功能向有利于自身健康的方面转化，从而对机体各系统产生积极作用的冬季活动。冷刺激可以使脂肪细胞线粒体上的 UCP 表达增加。当机体感受到寒冷刺激时，解除了生理状态下的抑制作用，使UCP 作用开通，致使氧化磷酸化产生热能。解偶联蛋白 UCP( uncoupling protein) 是线粒体阴离子载体蛋白家族中的成员，位于线粒体内膜。UCP 基因表达受多重调节，运动量、冷刺激以及 T3、视黄酸、胰岛素等对 UCP 基因家族的表达都有影响。实验只针对运动量、冷刺激进行大鼠解偶联蛋白 UCP 基因的研究，为冬游运动的科学性提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1. 1 实验动物及分组

　　清洁级 SD 雄性大鼠 32 只( 购于吉林大学实验动物中心) ，体重240 ～280 g。动物于 PLA-2 型自动送风养鼠笼中饲养，笼内温度( 24 ±3) ℃，相对湿度40% ～ 60% ，自由饮食，饮水，照明随同室内自然光变化。所用饲料为大鼠维持饲料( 购于吉林大学实验动物中心) ，适应性饲养 10 d 后进行实验。按照体重随机将 32 只 SD 雄性大鼠分为四组: 安静组A、3 min 游泳组 B，30 min 游泳组 C 和冬泳组 D，每组 8 只。

　　1. 2 实验动物模型制备

　　3 min 游泳对照 B 组接受 6 周水温 22 ℃ 的游泳训练; 30 min 游泳 C 组接受适应训练后，每天递增 3min 至 30 min，冬泳 D 组接受适应训练后，从 22 ℃水温开始每天递减 2 ℃，降至 8 ℃。大鼠均在长为100 cm，宽为 40 cm，水深为 60 cm 的水池中游泳，室内水槽自然状态下水温22 ℃，冬泳水温控制采用水槽中加冰的方法每天降2 ℃，逐渐降水温至8 ℃，游泳在每天上午进行，每周 6 d。

　　1. 3 实验动物取材

　　各组大鼠均于运动后即刻进行乙醚麻醉，断头处死。各组均取大鼠右后腿股四头肌肌肉置于10 mL离心管中，样本取材后置于液氮中速冻，然后 －80 ℃保存。

　　1. 4 主要试剂和仪器

　　乙醚溶液500 mL，5 × TBE 浓缩储液，0. 5 mol/LEDTA，溴化乙锭溶液 0. 5 mg / mL，氯仿，异丙醇，75% 乙醇，0. 1% DEPC 水，Trizol 试剂，吖啶橙染液，北京鼎国通用型 RT-PCR 试剂盒，山东产 202 型烘干箱，Germany MLE Z323K 台式高速冰冻离心机，北京产 PLA-2 型自动送风养鼠笼，北京产 ECP3000 电泳仪，USA UVP GDS-8000 紫外凝胶成像系统，UKTECHNE FFG02HSD PCR 仪。

　　1. 5 实验方法
　　
　　骨骼肌 UCP 基因表达测定通过大鼠骨四头肌深层肌肉 RNA 电泳结果、RT-PCR 反应电泳结果来反应 UCP 基因 mRNA 的相对表达量，在 RT-PCR 实验中设置的内参照物是内源性参照物 β-actin，他在各种动物细胞内高度表达。UCP 基因参考 ChrisinaM. Evock-Clover 等设计的引物序列，其扩增长度为 389 bp，浓度为 20 D，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。UCP 引物序列 UCP forward:GTGGATGCCTACAGGACCAT，UCP reverse: ATGAA-CATCACCACGTTCCA。β-actin 引物序列 β-actin or-ward: TGCGTGACATCAAGGAGAAG， β-actin re-verse: TGCCAGGGTACATTGTGGTA。

　　1. 6 数据处理与统计分析

　　使用 SPSS17. 0 进行数据分析，组间比较使用一维方差分析，所有数值均用平均数 ± 标准差，P ﹤0. 01 表示差异极显着。用 Alpha 紫外凝胶成像系统分析扩增片段大小。用 Lab words4. 0 分析软件对RT-PCR 结果进行光密度分析。

　　2 实验结果

　　2. 1 UCP 基因 RT-PCR 反应电泳结果

　　大鼠股四头肌深层肌肉 UCP 基因 RT-PCR 反应电泳结果见图 1，结果显示，冬泳训练后大鼠股四头肌 UCP/β-actin 的相对表达量结果在图上清晰可见，UCP 基因在大鼠冬泳训练后大鼠股四头肌肌肉组织中表达，且条带比较清晰、完整，UCP 的片段大小经分析约为 642 bp。【图1.略】
　　
　　2. 2 RT-PCR 电泳各条带凝胶密度分析结果

　　骨骼肌 UCP 基因 RT-PCR 电泳凝胶密度分析结果显示，UCP 基因在大鼠股四头肌中表达，C 组、D 组与 A 组、B 组相比 UCP 基因的 mRNA 表达量有明显增高趋势，差异极显着，且 C 组和 D 组之间的mRNA 表达量差异极显着，见表  1。【表1】

　　
　　3 讨论

　　UCP 在组织中分布广泛，主要在骨骼肌、脂肪组织和心脏表达最为密切，机体的一切运动由骨骼肌发起，任何动作都会导致 UCP 表达变化。体外实验证明，UCP 基因在转染的酵母中过量表达可导致酵母线粒体膜电位降低，表明 UCP 具有解偶联活性。UCP 是一个蛋白质家族，目前已发现的 UCP 有UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5 和 UCP6。UCP 的作用机制是通过解偶联作用降低细胞线粒体膜质子梯度，从而减少 ATP 生成，最终达到调节能量平衡的目的。UCP1 上要在棕色脂肪组织中表达，它的重要作用是调节脂肪的代谢，主要是通过驱散线粒体膜质子梯度来进行调节，当运动量增加到一定程度，需大量酯类参与功能，UCP1 表达增强，强度随运动量增加而增强。

　　运动量对 UCP 基因表达的影响。能量物质的氧化通过质子流与 ATP 的合成偶联，质子电化学梯度在 F0-F1-ATP 合成酶作用下使 ADP 磷酸化，形成ATP。呼吸作用使氧消耗与 ADP 磷酸化形成 ATP相互偶联，运动量增加导致耗氧量增大，启动 UCP基因解偶联机制。同时 UCP 基因在脂肪组织中表达，它的另一个重要作用是调节脂肪的代谢，通过驱散线粒体膜质子梯度进行调节，运动量增加到一定时间，就需要酯类物质参与供能，UCP 表达增强，强度随运动量增加而增强。本实验结果表明，C、D 组体酯含量极显着低于 A、B 组。C、D 组大鼠泳后的 UCP 基因 mRNA 表达结果极显着高于 A、B组，说明寒冷条件下的游泳和较大运动量的游泳均可使 UCP 基因表达增强，从而加强了机体的脂肪代谢。

　　冷刺激对 UCP 基因表达的影响。冬泳运动可使动物通过调节自身体温的基因进行表达，动物机体受到冷刺激后，加强自身的基础代谢产生热能。在冷环境刺激下，为了维护自身的体温，需要更多的细胞通过 UCP 解偶联产热，使 UCP 质子通道打开，导致氧化磷酸化解偶联而产热，以热能的形式散发出来。Vianna 等报道 UCP 基因参与产热作用的调控。实验结果表明，D 组大鼠泳后的UCP 基因表达显着上调，极显着地高于 A、B 组，且极显着地高于 C 组，说明游泳运动可使 UCP 基因表达增强，在寒冷条件下的游泳运动更能加强 UCP 基因的表达，UCP 的数量和活性决定机体的产热能力，当大鼠感受到冷刺激时，除正常生理应急抑制作用外，还可以使细胞 UCP 质子通道开放，致使机体氧化磷酸化作用解偶联产生热能。为使机体抵抗寒冷引起的机体体温下降，需更多的细胞通过 UCP 解偶联产热，释放更多的热能。大鼠 UCP 基因的表达可能涉及到很多因素，如基因的结构、基因的转录、基因的翻译等，其中每一个细小的环节都可使基因表达的改变，大鼠冬泳恢复后的 UCP 基因表达情况还有待于进一步的研究。

　　4 结论
　　
　　寒冷条件下的游泳和较大运动量的游泳均可使UCP 基因表达增强，加强机体的能量代谢，24 h 后UCP 基因表达恢复到正常水平。冬游与较大运动量的游泳相比，运动后即刻大鼠骨骼肌 UCP 基因表达升高，大鼠机体在外界低温的刺激下发生了诱导上调反应。

　　参 考 文 献
　　
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　　2 苏彦炬，霍少华，于动震，等． 冬泳和游泳运动对糖尿病大鼠病情影响的实验对比． 中国临床康复，2005; 9( 2) : 205—207
　　3 Evock-Clover C M，Poch S M，Richards M P，et al． Expression of anuncoupling protein gene homolog in chickens． Comparative Biochemit-ry and Physilolgy Part A，2002; 133( 1) : 345—358
　　4 Gimeno R E，Dembski M，Weng X，et al． Cloning and characterizationof an uncoupling protein homolog． Diabetes，1997; 46( 5) : 900—906
　　5 Mitchell P． Chemiosmotic coupling in oxidative and photosyntheticphosphorylation． Biol Rev Camb Philos Soc，1966; 41( 3) : 445—502
　　6 朱万龙，贾 婷，李宗翰，等． 冷驯化条件下大绒鼠的产热和能量代谢特征． 动物学报，2008; 54( 4) : 590—601