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血清多肽组的基本特征和个体差异探究

来源:分析化学 作者:孔祥怡,石锴,丛乐乐,
发布于:2017-06-20 共5452字
  摘 要 分析和比较疾病组及健康对照组的混合样品是血清多肽组生物标记物研究的常用方法,但对健康个体多肽组的差异和共性关注较少。本研究利用纳升液相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱鉴定健康人混合血清样品( 20 例) 的多肽组,阐明血清多肽组的分子量分布等一般特征,进而选取 6 例个体样品单独分析并与混合样品的分析结果进行比较,说明正常健康样品之间的个体差异和共同成分。结果表明,可鉴定序列的血清多肽组的分子量范围在 7000 Da 以下,纤维蛋白原 α 链等蛋白质所属肽段的检出频率最高,肽段在蛋白质水平上分布具有不均一性,排在前10%的蛋白质占据了约50%的总肽段,而后40%的蛋白质只有1 条检出肽段。此外,在所有样品中都检测到了来自于8 个蛋白质的12 个共同肽段,检测到了 N 端乙酰化、氨基酸氧化、磷酸化、脱氨化和脱水等翻译后修饰和明显的阶梯序列现象。本研究在肽段序列水平分析了血清多肽组的基本特征和个体差异,可为血清多肽组生物标志物研究提供参考。
  
  关键词 多肽组; 高分辨飞行时间质谱; 血清; 个体差异。
  
  1 引 言。
  
  生物体内的内源性多肽为蛋白质降解的产物,反映了蛋白质的降解过程,有些多肽还具有抗菌抗炎和信号传导等作用[1].多肽组学的概念最早出现于 2001 年,是指生物样品中的全部肽段,生物标记物和神经活性肽研究是多肽组学的两个最主要应用[2].生物标记物的一个主要来源是血液,随着蛋白质组学技术的完善和拓展,血清多肽组已成为基于质谱的血液生物标记物研究的重要方法。
  
  基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱( MALDI-TOF) 和纳升液相色谱-电喷雾串联质谱是进行多肽组研究的两种常用技术,但它们取得的多肽组数据及应用模式不同。MALDI-TOF 方法检测的是肽段分子量,在多肽组中也称为谱图轮廓( Spectra profile)[3 ~5].利用 MALDI-TOF 方法筛选生物标记物首先需要在疾病组与对照组中找到相同分子量的质谱峰,然后比较它们离子强度的差异[6,7],本方法的优势在于简单、直观、质量检测范围较宽,并且 MALDI 源与傅里叶变换离子回旋共振质谱或串联飞行时间质谱( TOF/TOF) 联用也可以获得序列信息[8,9].但是,在 MALDI-TOF/TOF 仪器中非酶切肽段的断裂效率通常不够充分,此外,使用 MALDI 源质谱获得的多肽组的体量相对较小,这可能与 MALDI-TOF 仪器较少与液相色谱联用和 MALDI 源中的电离抑制作用有关,例如,即使对于蛋白质标准品的酶切产物也较难检测到全部的酶切肽段[10].利用纳升液相色谱-串联质谱技术则不仅显着增加了肽段鉴定能力和数目,也可以与标记或非标记技术联用实现相对定量[11,12],但是,尽管该技术拓展了血清多肽组的范围,在应用模式上同样为比较疾病组和健康对照组的混合样品,对个体差异重视不够,目前,尚未有关健康个体样品血清多肽组差异程度的报道。
  
  本研究利用氧化石墨烯-磷酸镧纳米磁性复合材料( LaGM) 分离和富集血液多肽[13],利用纳升液相色谱-高分辨串联质谱( Nano LC-TripleTOFTM5600) 首先分析健康人的混合血清样本,确定多肽组的分子量范围、肽段分布和磷酸化等翻译后修饰特征,然后对比分析另外 6 个健康个体的血清样品,探讨血清多肽组的个体差异和共性。
  
  2 实验部分。
  
  2. 1 仪器与试剂。
  
  Eksigent nanoLC-UltraTM2D 系统、TripleTOF 5600 + 高分辨质谱仪、Protein Pilot 4. 5 软件 ( AB SCI-EX) ; 真空冷冻干燥机( Thermo Savant) .
  
  氧化石墨烯-磷酸镧纳米磁性复合材料,纳升液相色谱流动相 A 为 0. 1% 甲酸-2% 乙腈,流动相 B为 0. 1% 甲酸-98% 乙腈,C18反相色谱捕集柱、C18反相色谱分析柱。
  
  2. 2 多肽的分离和富集。
  
  30 μL 人血清样品溶解于 500 μL 去离子水,与 20 μL 30 mg / mL LaGM 复合材料混合,在冰水浴中涡旋 2 min,1000 r/min 振荡 10 min.1000 r/min 离心 5 min,磁分离,在沉淀物中加入 500 μL 水,涡旋1 min,振荡 5 min,磁分离,去掉上层清液,重复 2 次。在沉淀中加入 20 μL 80% 乙腈+1% 三氟乙酸的洗脱液,涡旋 1 min,振荡 5 min,磁分离,收集上层清液并冷冻干燥。
  
  2. 3 反相色谱-TripleTOF 质谱分析。
  
  将分离冻干的多肽样品溶解于 Nano-RPLC Buffer A 中,在线 Nano-RPLC 液相色谱在 EksigentnanoLC-UltraTM2D 系统 ( AB SCIEX ) 进行,溶解后的样品以 2 μL / min 的流速上样到 C18预柱上( 100 μm×3 cm,3 μm,15 nm) ,然后保持流速冲洗脱盐 10 min.分析柱是 C18反相色谱柱( 75 μm×3 cm,3 μm,12 nm,ChromXP Eksigent) ,梯度洗脱条件: 0 ~ 42 min,5% ~ 25% B; 42 ~ 56 min,25% ~40% B; 56 ~ 64 min,80% B; 64 ~ 70 min,5% B.质谱采用 TripleTOF 5600 + 系统( AB SCIEX) .纳升喷雾 III 离子源( AB SCIEX,USA) ,喷雾电压为2. 4 kV,气帘气压为207 kPa,雾化气压为34. 5 kPa,加热温度为 150℃,质谱扫描方式为数据依赖的采集工作模式( IDA information dependent analysis) ,一级TOF-MS 单张图谱扫描时间为 250 ms,每次 IDA 循环下最多采集 35 个电荷为 2 + ~ 7 +且单秒计数大于100 的二级图谱,每张二级图谱的累积时间为 80 ms.
  
  2. 4 数据分析条件。
  
  质谱采集到的原始 wiff 图谱文件,采用 Protein pilot software v. 4. 5 软件进行数据加工处理和检索分析,数据库为 Uniprot 库中的 Homo sapiens 人种专一数据库( 包含 20210 条蛋白质序列,2015 年 1 月2 日下载) ,检索参数设置为非酶切、磷酸化强调和生物学修饰,数据库: uniprot_Homo sapiens( 20210 条蛋白质序列) ,假阳性率控制为 1% FDR.
  
  3 结果与讨论。
  
  3. 1 血清多肽组特征及其在蛋白质水平上的分布。
  
  在本研究中将序列相同但翻译后修饰不同的肽段视为不同肽段,共检测到归属于 64 个蛋白质的361 条特异性肽段,95% 置信度下这些蛋白质覆盖率为从 1% 变化至 97%.它们的质荷比 m/z 402 ~1046,肽段电荷数为 2 ~ 7,等电点 3. 37 ~ 12. 01,一级质量误差均小于 5 ppm,分子量分布为 863 ~6500,以 1 ~ 2 kDa 的肽段数目为最多,但在 7 kDa分子量以下均有肽段被鉴定( 图 1) .与文献[14]一致,本研究也发现肽段在蛋白质水平上并不是平均分布。例如,搜库得分第一位的纤维蛋白原 α 链有83 条肽段,是总检出肽段数目的 23% ,排位前 20% 的蛋白质占有了 68% 以上的总肽段数,而排名在后 40%的 26 种蛋白质都只有 1 条肽段被检测。在此混合样品中,鉴定排名在前 15 位的蛋白质及其相应的肽段鉴定数目如表 1 所示。此外,检出到了磷酸化、侧链氨基酸残基氧化、N 端焦谷氨酸化、脱水和脱氨等多种翻译后修饰现象,例如,在此样本集中共检测到 26 个氧化肽段和 11 个磷酸化肽段,例如,肽段 GPPGPPGPPGPPGPPS 来自于胶原蛋白 α-1?链,其氮端 3,6,9 和 12 位的脯氨酸残基均被氧化,由于在串联质谱中鉴定到了 b2 ~ b14 和 y2 ~ y12 的连续碎片离子( 图 2) ,所以脯氨酸氧化位点可准确给出。肽段 ADSGEGDFLAEGGGVR 来自于纤维蛋白原 α 链,在其 N 端 3 位的丝氨酸残基上发生了磷酸化,同样观察到了近似连续的 b 和 y 系列离子( 图 3) ,说明鉴定结果可靠。
        
        图 1 血清多肽组分子量分布图
  
  表 1 混合血清中前 15 种蛋白质所对应的肽段数目和鉴定得分
  
  图 2 肽段 GPP( O) GPP( O) GPP( O) GPP( O) GPPS 的串联质谱图
  
  图 3 肽段 ADS( Phospho) GEGDFLAEGGGVR 的串联质谱图
  
作者单位:
原文出处:孔祥怡,石锴,丛乐乐,王静,蒋立军,洪晓愉,李水明,王勇,赵晴. 血清多肽组及其个体差异的纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析[J]. 分析化学,2017,(01):133-138.
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