聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR[1],是一种分子生物学技术,用于放大扩增特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。我科近年来采用PCR技术对乙肝患者的血清资料进行检测分析,为比较PCR与传统检测方法的差异,特与采用传统检测手段患者资料进行对照分析,现综合报道如下。
一、资料与方法
1.一般资料:随机抽取于2013年6月在我院乙肝治疗的50例患者,年龄分布为20~60岁。调查的50例患者均为乙肝患者,全身均无系统性疾病和药物过敏史。患者需要进行采血、化验等辅助检查。现将50例患者随机分为实验组和对照组,实验组人数30人,男12人、女18人,对照组人数20人,男11人、女9人。分组完全按照随机分组的方法来进行分组,两组患者在年龄、性别及疾病原因等方面比较,差异不显著,不具有统计学意义,具有可比性。
2.纳入和评价标准:纳入标准:年龄在20~60岁的乙肝患者;没有免疫缺陷等疾病、智力正常、自然状况一切正常[2];排除标准:存在感觉功能缺陷;先天性的疾病;高血压等。
3.方法:实验组采取PCR检测技术,对照组采取传统检验方法,即常规的物化检测。两组的用药方法用量相同,均采用局部浸润方法注射。对照组:常规检测技术;实验组:采用PCR技术,根据对乙肝患者抗原抗体检测的敏感度进行评价。
4.效果评价标准:观察检测抗原抗体的数量和灵敏度[3]作为评估标准。
5.统计学处理:采集到的数据采用SPSS15.0软件进行统计学分析,百分率(%)表示计数资料,定性资料的比较采用χ2检验,成组设计的t检验用于组间比较,当P<0.05时,可认为差异有统计学意义。
二、结果
两组的检测效果统计情况见表1。
表中的数据显示P值小于0.05,表示调查结果具有统计学意义,即表明PCR技术对乙肝的检测优于传统学检测。
讨论PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。医学检验是对病人的血液、体液、分泌物或脱落细胞等标本,进行化验检查,以获得病原、病理变化及脏器功能状态等资料。通过对患者的上述标本进行医学检验,达到对患者疾病进行诊断与辅助诊断的目的。
ELISA测定的是乙肝病毒表达的蛋白质(多肽)抗原或相应的抗体。FQ-PCR测定乙肝病毒DNA。检测HBV-DNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”。ELISA方法测定乙肝五项指标依然是辅助诊断乙肝的常规方法,特别对急性乙肝的发现有重要作用,只是该方法对检测慢性乙肝表现得越来越不灵敏,特别是在乙肝病毒发生了变异以后,需要进行HBV-DNA检测才能确诊。在技术上,FQ-PCR采用荧光标记和闭管检测,克服了常规PCR扩增产物污染所致假阳性的缺点,使结果具有极高的特异性和敏感性。但在分析FQ-PCR结果时,还应考虑以下因素:FQ-PCR的反应体系复杂,易受多种因素影响。待测标本的溶血、脂血、处理不当都会导致其假阳性或假阴性;FQ-PCR只能检测血中游离的HBV-DNA,当病毒整合到肝细胞染色体上,随同肝细胞一起复制、表达时,ELISA可出现阳性反应,但血清中已没有HBV颗粒存在[4],此时FQ-PCR为阴性反应;当患者感染的HBV-DNA发生突变,不能与荧光探针结合,FQ-PCR为阴性,而ELISA可为阳性;当患者处于恢复期或既往感染,ELISA检测乙肝五项指标可有多种模式。因此,在乙肝病毒感染的诊断上,二者有各自的优点,不可互相替代。
从表1研究结果可以看出,观察组采用PCR技术检测乙肝患者表面抗原,具有较高的检测敏感性,两组结果比较结果具有显著性差异。因此FQ-PCR检测定量HBV-DNA客观地反映了HBV感染、复制及病程变化,修正或补充了对ELISA测定结果的解释,特别是在病毒感染早期,ELISA不能检测到低滴度的病毒抗原时,FQ-PCR即可检测到HBV-DNA的复制,有利于乙肝的早期诊断。对于用干扰素等药物治疗的患者,测定治疗前后病毒核酸的拷贝数,有利于疗效观察及预后判断。
参考文献:
[1]李伟,李峰生,陈舒,等.乙肝病毒血清hbv-DNA标记物与血清的关系[J].细胞与分子免疫学杂志,2011,24:818,821.
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[3]林杓锋,李校坤,吴帆,等.实行定量PCR在乙型肝炎(HBV)诊断中的应用[J].中国生物工程杂志,2012,22(3):68-70.
[4]张健,李宁,吕维红,等.HBV-DNA定量测定对乙肝五项的评价意义[J].中华中医学杂志,2013,25(1):15-17.
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