免疫组化的染色操作的质控管理

　　免疫组化染色是一项综合性的操作技术，其影响因素复杂，加强质量管理和提高可信性尤为重要。我科从 2001 年开展免疫组化染色，在具体的操作过程中进行了精细而有效的全程质控，现将质控事项综述如下。

　　1、 标本固定

　　固定液为 4%中性缓冲甲醛( 10 ml 甲醛 +90 ml PBS 缓冲液) 。要求离体后及时固定，固定液的量为标本体积的5 ～ 10 倍。固定不当，固定时间不够或过长，都可引起抗原丢失，尤其是一些较脆弱的膜抗原( 如 CD20 等) ，故固定应及时并充分。取材后小标本固定时间应 ＞ 6 h，肿瘤标本最好 ＞ 24 h。

　　对于淋巴结、根治标本应及时切开固定。

　　2、 切片、烤片、脱蜡

　　免疫组化染色要求切片薄而完整。一般切片厚度为3 ～4 μm，淋巴组织可切2 μm。切片应平整，因为切片褶皱、边缘卷曲可造成试剂难以冲洗干净，这在手工染色时尤为重要。否则显色时这些区域就有可能出现背景着色，影响整张切片的染色质量。

　　清洁时要求展片用水和容器均保证干净，避免污染，干扰阅片。烤片温度不宜过高，65℃ ～70℃烤片 1 ～2 h即可。烤片时间短易造成脱片，温度高或过长易导致抗原丢失。脱蜡不彻底，蜡膜会阻碍抗体渗入从而阻止抗体与抗原的结合。我科采用三级松节油脱蜡，每级 10 ～ 15 min，并且每 200 张切片更换第一缸松节油，保证脱蜡彻底。用松节油脱蜡的染色效果与二甲苯脱蜡基本一致。

　　3、 减少非特异性染色

　　当使用辣根过氧化物酶检测系统时，可在滴加一抗前用3% H2O2作用 10 ～15 min，以便阻断组织中的内源性过氧化物酶。

　　4、 对照

　　对照的设立在免疫组化操作中极为重要。在日常工作中设立阳性对照又是关键中之关键。阑尾组织中含有多种组织成分，如上皮组织、淋巴组织、平滑肌组织、间质、神经组织、血管、间皮等，所以常选用阑尾作为阳性组织对照。

　　5、 抗原修复

　　修复方法有高压锅修复、水浴修复、微波修复等。我科大多采用高压锅法，高压锅内加入 0． 01 mol/L pH6． 0 的柠檬酸盐缓冲液 2000 ml，放置在电磁炉上，用大功率加热至沸腾，然后将功率调至中档再放入切片，加盖，加减压阀继续加热至冒气并维持 2 min 后，撤火缓慢冷却。高压锅修复法具有压力稳定，受热均匀，背景着色浅等优点。对于核染色阳性的抗原用 pH9． 0 的 EDTA 修复液效果好; 胞质、胞膜染色阳性的用 pH8．0 的 EDTA 抗原修复液效果好。

　　6、 显色

　　如果发现配制好的 DAB 显色液中出现棕色沉淀则此显色液可能失效，建议重新配制。在显色时，一般阳性部分广泛或阳性定位在胞质的组织，显色非常迅速，1 ～ 3 min 即可见明显的棕色，应及时终止显色。阳性部分稀少且定位在胞核的组织，则需要显微镜下观察，时间不宜过长以免造成背景染色。

　　7、 复染

　　复染是为了衬托免疫组化的阳性染色，所以苏木精颜色不宜太深，同时由于操作中使用了吸附玻片，所以建议复染的苏木精应勤于过滤，减少人为的背景染色。

　　8、 染色中的一些细节

　　在整个染色过程中，切片始终保持湿润，不能干片。滴加一抗时应将切片上的水甩干，以免抗体被稀释。滴加抗体时要确保覆盖全部组织，以免边缘未覆盖到抗体，引起边缘效应。同时孵育盒要放平，以免抗体流至组织一端，造成假阴性或局部弱阳性结果。

　　综上所述，质控工作总是发生在实验检测前才能生效。

　　如标本制作前的处理固定以及制作中的质控流程和切片质量对免疫组化的染色效果，都是相互影响、相互依存的。在免疫组化操作过程中，有许多至关重要的步骤，都是一环扣一环，每走一步都要进行有效监控，才能做出高质量的切片。因此要求操作人员有高度的责任心，严格遵循操作规范，为病理诊断提供表达准确、染色清晰的高质量的免疫组化染色。