DRD4基因的多态性与人认知能力的关系

　　人类认知能力是人类顺利完成包括知觉、感觉等低水平活动以及想象、推理、思维等高级能力时重要的心理条件，反应人脑对信息加工、存储及提取的能力。早期基于双生子研究结果表明人类的认知能力具有坚实的遗传基础，其遗传度约在 40%~80%.

　　随后在寻找帕金森、注意缺陷多动症等精神类疾病致病基因的同时，发现多个与人类认知能力存在相关性的基因（Egan et al., 2001; Bilder et al., 2002; Chi-urazzi et al., 2004; Ucok et al., 2007; Woodward et al.,2007）。目前已有研究显示人脑的认知功能受多基因影响和控制，而神经递质代谢通路中的有关基因甚至发挥主效基因的作用。特别对中枢神经系统中多巴胺神经递质通路有关基因的研究发现，老年人认知功能下降以及帕金森病等都与该通路中的相关基因有关。本研究选取多巴胺递质通路多巴胺 D4 受体基因（DRD4），该基因集中分布于与认知和情感相关的前额叶皮质背外侧和脑边缘系统，参与知觉和智力、记忆和语言等认知行为以及情绪、情感反应。已有研究报道，该基因与认知障碍或精神性疾病有关，在对精神病人尸检研究发现其脑 DRD4 受体是正常人的 6 倍。研究表明该基因有关突变与注意缺陷多动症、人格障碍等神经性疾病有关，且这一基因还被认为与工作记忆、注意控制等认知能力有关，而现有观点主要源于对帕金森和精神分裂症人群的研究。

　　目前对 DRD4 基因的正常多态是否影响正常人类的认知能力还不清楚，本研究以 DRD4 基因为目标基因，以中国正常汉族人群为对象，选取 DRD4 基因上rs1800955、rs936461 两个功能 SNP 位点，通过研究这些 SNP 位点的多态性，探讨 DRD4 基因的多态性与人认知能力的关系。

　　1 结果与分析

　　1.1 哈德 - 温伯格平衡检验及各 SNP 位点基因型频率分布的性别差异检验

　　使用 Finetti 软件对两个 SNP 位点进行 Harder-Weniberg 平衡检验，各位点基因型频率及哈温平衡结果 p 均大于0.05,均符合 Harder-Weniberg 平衡。此外，两个位点基因型频率性别差异检验结果显示 p 均大于 0.05,表明各位点基因型频率分布不存在性别差异，因此在后续分析中不考虑性别基因型的差异。

　　1.2 认知变量的性别差异检验

　　为了消除不同性别对认知测验成绩的影响，采用参数检验中的独立样本 t 检验对各认知变量进行性别差异检验分析，对于 p 值小于0.05 的认知成绩在以后统计分析时须分性别分别进行分析。各认知变量的性别差异检验结果（表 1）。

　　1.3 DRD4 基因与大学生认知能力的相关性分析

　　采用单因素 ANOVA 分析统计法对 DRD4 基因rs1800955 和 rs936461 两个启动子区 SNP 位点与人类认知能力进行相关性分析。

　　1.3.1 rs1800955 位点与认知能力的相关性分析

　　SNP rs1800955 位点在样本人群中表现出与长时记忆能力的数字回忆相关（p=0.046），但经校正后p值为0.092,显着性消失（表 2）。

　　1.3.2 SNP rs936461 位点与认知能力的相关性分析

　　SNP rs936461 位点在人群样本的男性群体中与中央执行功能的刷新测验成绩显着相关（p=0.017），该群体还与空间认知能力的三维旋转呈现阳性结果（p=0.046），但经校正后该男性群体只与人类中央执行功能的刷新测验成绩显着相关（p=0.034） （表 3）。

　　以上所有分析结果提示，DRD4 基因上rs1800955与长时记忆能力关联 p 值经校正后不存在显着性（p=0.092），rs936461 与男性中央执行功能关联 p 值校正后仍然存在显着性（p=0.034），与男性人群的空间认知能力 p 值校正后不存在显着性（p=0.092）。说明 DRD4基因可能与人的中央执行功能有关。

　　2 讨论

　　多巴胺（dopamine, DA）是一种在前额叶活动相关认知能力中起关键作用的神经递质，如中央执行功能、言语认知等高级认知功能。研究表明，人脑内多巴胺浓度异常会影响人类认知能力，甚至引起以智力障碍为特征的各神经系统或精神类疾病。本研究我们选取多巴胺递质系统中 DRD4 受体基因，在健康的大学生随机样本人群中探讨其多态性与认知能力的关系。

　　DRD4 类属 D2 样多巴胺受体家族，可以通过与G 蛋白偶联抑制腺苷酸环化酶的活性。该基因可介导多巴胺的突触后活性，主要分布于大脑边缘和前额叶皮质背外侧，该区域被认为对认知能力起关键调节作用，因此 DRD4 基因越来越得到认知遗传领域学者的重视。DRD4 基因的mRNA （约 5.3 kb）集中分布于大脑皮层边缘系统，提示该基因在情绪和认知中扮演重要角色（Meador-Woodruff et al., 1994）。已有研究表明 DRD4 启动子区的多态性位点能通过改变启动子与 mRNA 聚合酶的亲和性继而影响蛋白质的表达和功能（Lai et al., 2010）。Lichter 等（1993）认为此蛋白区的变异可能存在以下作用：（1）通过胞环结构的不同改变跨膜区的构型；（2）改变下调 G 蛋白或其它胞内蛋白间的相互作用，继而影响信号的传导。

　　本研究的基因启动子区位点 rs1800955（-521T/C）和 rs936461 （-809G/A）在认知遗传领域研究相对较少。对于 rs1800955 的研究，在我们的人群样本中没有表现出与认知能力的显着关联。2005 年 Bellgrove等（2005）在对 ADHD 患者研究中发现存在 -521T 等位基因的患者在反应抑制的认知任务中表现差。但我们的样本中并没有显现出与抑制任务测试相关，可能由某些原因如样本量的大小、研究对象、认知测验范式不同导致。对于 rs936461 多态性研究，我们发现其多态性与样本人群中男性群体的刷新测验（属于中央执行功能）成绩存在显着相关（p=0.034）。有意思的是在我们的样本人群中，纯合子男性群体在完成中央执行功能的刷新任务时比杂合子群体表现出较少的刷新次数，这提示该位点多态性并不是通过等位基因的剂量效应来影响中央执行功能的。

　　总之，本研究 790 名大学生 DRD4 基因与其认知能力的关系，其结果提示 DRD4 基因可能与人的中央执行功能相关。但是，未来还需在更大的样本，选择更多的遗传标记来进一步确证 DRD4 基因与人类认知能力的关系。

　　3 材料与方法

　　3.1 材料

　　样本来自西安某高校按照学生学号随机抽取的年龄在 18~22 岁之间的 790 名汉族健康大学生。他们来自国内不同省份，无任何亲缘关系。在保证研究对象知情的原则下进行口腔黏膜细胞样品采集，并对研究对象信息及测验结果严格保密。

　　3.2 方法

　　3.2.1 认知能力测验

　　本研究所涉及的 6 类认知能力（长时记忆能力， 空间认知能力， 中央执行功能， 工作记忆， 言语认知能力及一般流体智力）均采用国际上目前公认且广泛使用的认知测试范式。并且都通过由 Arizona 大学Jonathan 和 Ken Forster 等人开发的 DMDX 软件平台完成认知测验任务（除一般流体智力外）的编制。所有认知测试都由经过严格培训的主试指导并在计算机上完成。具体测验如下：工作记忆（working menmory-WM）：包含视空间工作记忆和数字工作记忆两类测试。其中视空间工作记忆广度测试在 Hegarty、Shap、Miyake （Hegarty etal., 2000）点矩阵实验的基础上进行改编，数字工作记忆广度测试任务程序与刘昌教授（刘昌， 2004, 南京师大学报， （3）： 81-88）和 Hegarty 等（2000）人的实验设计相似。两测试均以广度、反应均时为测量指标。

　　长时记忆（long term memory-LTM）：包括词语再认任务和数字回忆任务。其中词语再认采用 Tulving等（1989）提出的 R/K 判断测验范式（R 为 remember-ing, K 为 knowing），以再认率（%）作为测量指标；数字回忆任务采用中科院心理所李德明所编"基本认知能力测验"中的"三位数再认",以回忆率（%）为衡量指标。

　　空间认知能力（spatialcognitiveability-SCA）：本研究将 H.W. Gordon 编制的认知侧化测验（Gordon,1986）进行改编，并选取其中空间定位、三维旋转和积木连接任务三子测验对受试者进行测试，分别以以定位均距（mm）、反应均时（ms）错误率（%）为测量指标。

　　言语认知能力（verbal cognitive abilities-VCA）：采用句子理解和言语类比推理两类测验。句子理解实验采用句图匹配范式（Clark et al., 1972），言语类比推理实验范式采用 A:B 推出 C:D 的类比推理实验经典形式。测试均以反应均时（ms）、错误率（%）为衡量指标。

　　中央执行功能（centralexecutivefunction-CEF）：以Miyake 等（2000）人用潜变量分析法将中央执行功能分离为转换、抑制和刷新三种子成分为理论基础，本研究对此三种功能进行测验。抑制功能的测验参考Nieuwenhuis 等（2000）的范式反向线索任务（anti-cue）改编，刷新任务和转换任务均根据 Miyake 等（2000）的实验范式改编。其中抑制、转换任务测试均以反应均时差（ms）、错误率（%）为测量指标，刷新任务以刷新次数为测量指标。

　　一般流体智力（generalfluidintelligence-GFI）测试采用瑞文标准推理测验，以测验粗分作为其衡量指标。

　　3.2.2DNA 遗传物质的提取与贮存

　　在知情同意的原则下，取无菌医用拭子采集测试者的口腔黏膜组织样本，采集前，均要求测试者用清水漱口 3~4 次以清理口腔中的食物残留物等。组织样品采用 Chelex-100 法提取全基因组 DNA,将提取出的 DNA 稀释液放置 4℃保存待用或于 -80℃保存。

　　3.2.3SNP 位点选取与引物设计

　　根据美国生物信息中心（nationalcenterforbiology,NCBI）提供的相关信息，依据：（1）汉族人群具较高杂合度；（2）具生物学功能或近功能域为原则选择遗传标记。最终选取了 DRD4 基因上rs1800955 （-521C/T）（MAF=0.20）和 rs936461（-809G/A）（MAF=0.34）。两者均位于 DRD4 基因5' 端启动子区，定位于 -900 到+500 位置的 CpG 岛上。

　　PCR 扩增体系为 5滋L:内含 PCR TaqMix （2伊）2.5滋L、DNA 模板 0.3滋L、25滋mol/L 正反向引物各0.2滋L、ddH2O1.8滋L（表 4）。

　　3.2.4基因型检测

　　采用单链构象多态性方法（PCR-SSCP）进行基因分型，取变性剂（95%甲酰胺， 5MEDTA, 少许溴酚蓝和二甲苯氰）将 PCR 产物 98℃变性 10 min,迅速冰浴 30 min,使其形成具有相对稳定二级空间构象的单链 DNA,上样至聚丙烯酰胺凝胶中，置于 4℃冰柜中电泳，银染后通过凝胶成像进行基因分型（杨延桂等， 2011）。最终通过测序确定电泳条带对应的基因型，近而确定个体基因型。

　　3.2.5数据分析

　　根据认知测验结果统计指标，剔除不合理的认知数据和非汉族个体。对 SNP 位点的 Harder-Weniberg平衡检验采用 Finttni 软件进行（Sasieni,1997）。针对各位点基因多态性与认知能力的相关性分析，采用SPSS 软件中单因素方差分析。所有阳性结果经过校正且显着性阈值水平为（p<0.05）。

　　作者贡献郑淑负责本文框架构思，是文章主要撰写者；池万余提供数据分析；高晓彩为通讯作者，指导论文撰写；全体作者都为本文成稿做出贡献。

　　致谢

　　本研究由国家自然科学基金项目（编号：31340028）、教育部人文社会科学研究项目（编号：13YJCZH081）和西北大学研究生自主创新基金资助项目（YZZ13065）共同资助。