不同光照强度和温度对烟叶唇柱苣苔无菌叶片培养的作用

　　烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha Merr.）是苦苣苔科唇柱苣苔属多年生草本，生于海拔约 430 m 的山谷林中或溪边石上，是海南省特有的野生花卉，具有极大的开发潜力 。

　　汤正辉对烟叶唇柱苣苔叶片不定芽的分化及生根进行了研究，但有关光照及温度等环境条件在其离体培养中的影响未见有报道。本试验以烟叶唇柱苣苔无菌叶片作为试验材料，研究了不同光照强度和温度对叶片不定芽的分化、增殖以及生根的影响，以期筛选出各培养阶段最为合适的光照强度和温度。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　植株采自海南省保亭县，取幼叶作为外植体材料。供试植物生长调节剂为 6-BA（6-苄基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）。基本培养基为 MS。

　　1.2 试验设计
　　以 MS 为基本培养基，根据试验目的添加植物生长调节剂 6-BA 和 NAA，附加白糖 30 g/L、卡拉胶 9 g/L，灭菌前 pH值为 5.8，配制分装后，于温度 121 ℃、压力 0.14 MPa 高温高压下灭菌 20 min。材料接种后移入培养室，光照强度设置1 000、1 500、2 000 lx 等 3 个处理 ，温度设置 25、28、31 ℃ 3个处理，光照时间 8 h/d，每个处理接种 8 袋，每袋 3 个材料，3 次重复，定期观察记录，培养 40 d 后统计结果。

　　1.3 试验方法
　　1.3.1 无菌材料的建立 。将烟叶唇柱苣苔的幼嫩叶片在自来水中洗去污物，用棉花蘸洗洁精液擦拭叶片两面，冲洗干净后移入超净工作台，先用 75%酒精浸泡 10 s，再用 0.2‰HgCl2溶液浸泡 3 min，无菌水冲洗 3 次，最后用 2%次氯酸钠溶液浸泡 15 min，无菌水冲洗 5 次。将叶片切成 1 cm×1 cm见方的小块，以叶背朝下接种于 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L 培养基上。接种 15 d 后，叶面开始膨大隆起，25 d 开始有小芽点萌动，40 d 在叶片边缘、主叶脉基部和叶面处均分化出不定芽。取不定芽叶片作为研究试验材料。

　　1.3.2 不定芽的诱导
　　（1）光照强度对叶片不定芽诱导的影响 。取无菌植株小叶片（约 0.5 cm×0.5 cm）以叶背接入 MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L 培养基，置于温度 28 ℃、不同光照强度的培养室中，培养 40 d 后统计叶片不定芽诱导率和平均不定芽数。

　　（2）温度对叶片不定芽诱导的影响 。取无菌植株小叶片（约 0.5 cm×0.5 cm）以叶背接入 MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1mg/L 培养基上，置于光照强度 1 500 lx、不同温度的培养室中，40 d 后统计叶片不定芽诱导率和平均不定芽数。

　　1.3.3 不定芽的增殖
　　（1）光照强度对不定芽增殖的影响 。 将单个不定芽接入 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L 培养基中，置于温度28 ℃、不同光照强度的培养室中 ，培养 40 d 后统计不定芽增殖倍数。

　　（2）温度对叶片不定芽增殖的影响 。将单个不定芽接入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L 培养基中 ，置于光照强度1 500 lx、不同温度的培养室中，40 d 后统计不定芽增殖倍数。

　　1.3.4 生根培养
　　（1）光照强度对不定芽生根的影响 。将高度达到 1.2 cm的不定芽接入 MS+NAA 0.5 mg/L 培养基中，置于温度 28 ℃、不同光照强度的培养室中，培养 30 d 后统计不定芽生根率、生根数、株高。

　　（2）温度对不定芽生根的影响。将高度达到 1.2 cm 的不定芽接入 MS+NAA0.5mg/L 培养基中，置于光照强度 1500lx、不同温度的培养室中培养，30 d 后统计不定芽生根率、生根数、株高和最长根。

　　1.4 统计方法
　　计算公式为：不定芽诱导率（%）=诱导出芽叶片数/接种叶片数×100，平均不定芽数=不定芽总数/诱导出芽叶片数，不定芽增殖倍数=培养 40 d 不定芽总数/接种不定芽数，生根率（%）=生根植株数/接种植株数×100，生根数=植株生根总数/生根植株数。试验结果均进行方差分析，F 测验显着后用新复极差法（SSR）进行多重比较，统计结果均为 99%水平。

　　2 结果与分析

　　2.1 不定芽的诱导
　　（1）不同光照强度对烟叶唇柱苣苔叶片不定芽诱导的影响。由表 1 可知，光照强度 1 000 lx 时，烟叶唇柱苣苔不定芽诱导率和平均不定芽数最高，分别为 95.83%和 7.10 个/叶，芽的生长势最好；光照强度为 1 500 lx 时，不定芽诱导率较低，为 83.33%，平均不定芽数为 5.50 个/叶，芽生长势较差；光照强度 2 000 lx 时，不定芽诱导率最低为 68.18%，平均不定芽数也最小为 3.36 个/叶，芽的生长势最差，可见光照强度高于 1 000 lx 时不利于芽的分化和生长，光照强度越高，诱导效果越差。方差分析结果表明，3 种光照强度之间不定芽诱导率和平均不定芽数的差异达到极显着水平，因此烟叶唇柱苣苔叶片不定芽诱导的最适宜光照强度为 1 000 lx。【表1】

　　（2）不同温度对烟叶唇柱苣苔叶片不定芽诱导的影响
　　由表 2 可知，培养温度 28 ℃的不定芽诱导效果最好，不定芽诱导率最高，达到 94.74%，平均每叶分化不定芽数最多，为 7.34 个，极显着高于其他处理；25 ℃的不定芽诱导率和平均不定芽数次之，与 31 ℃的不定芽诱导率差异极显着，而平均不定芽数差异极不显着。从生长势看，28 ℃的不定芽生长势最好，25 ℃的次之，31 ℃的最差。因此，烟叶唇柱苣苔叶片不定芽诱导最佳温度为 28 ℃。
　　
　　2.2 不定芽增殖
　　（1）不同光照强度对烟叶唇柱苣苔不定芽增殖的影响 。【表2】

　　
　　由表 3 可知，不同光照强度对烟叶唇柱苣苔不定芽增殖的影响极大，各处理间的差异达到极显着水平，其中 1 500 lx的光照强度对不定芽的诱导生长效果最好，40 d 不定芽增殖倍数达到 7.24 倍，极显着高于其他各处理，而且不定芽长势好，芽苗健壮，叶色深绿。1 000 lx 的不定芽增殖倍数为6.66 倍，极显着高于 2 000 lx 的增殖倍数，由此可见，烟叶唇柱苣苔不定芽的增殖不需要太强的光照，1 500 lx 的光照强度最适宜不定芽的增殖与生长。（2）不同温度对烟叶唇柱苣苔不定芽增殖的影响 。由表4 可知，在 28 ℃温度下培养 40 d，烟叶唇柱苣苔不定芽的增殖倍数最高，达到 7.09 倍，其次是 25 ℃，增殖倍数为 6.28倍，最低的是 31 ℃，只有 3.93 倍。方差分析结果表明，25 ℃和 28 ℃的增殖倍数差异极不显着，而二者与 31 ℃的差异极为显着。从生长势看，25 ℃和 28 ℃温度培养下，不定芽长势好，芽体健壮，31 ℃培养温度芽苗长势差、芽细、有较多的枯叶。因此，烟叶唇柱苣苔不定芽增殖与生长的适宜的温度为25~28 ℃，最佳温度为 28 ℃。【表3-4】

　　2.3 不定芽生根

　　（1）不同光照强度对烟叶唇柱苣苔不定芽生根的影响
　　由表 5 可知，3 种光照强度对烟叶唇柱苣苔生根数、株高和生长势的影响不明显，三者之间的差异极不显着；而对生根率则有一定的影响，1 000 lx 和 1 500 lx 的生根率达到 100.00%，二者与 2 000 lx 的生根率 97.78%差异极显着。因此，烟叶唇柱苣苔叶片不定芽生根的适宜光照强度为 1 000~1 500 lx，最佳光照强度为 1 500 lx。【表5】

　　（2）不同温度对烟叶唇柱苣苔不定芽生根的影响
　　由表6 可知 ，28 ℃的诱根效果最好 ，烟叶唇柱苣苔生根率 、生根数和株高分别为 100.00%、18.92 条、2.18 cm，与 25 ℃的生根率和株高差异极不显着，生根数的差异则达到极显着水平；28 ℃与 31 ℃的生根率 、生根数和株高的差异 ，则达到极显着水平。从生长状况看，在 25~28 ℃的温度下培养，植株健壮，叶色浓绿；31 ℃的培养温度下，植株生长势差，细弱矮小，叶色枯黄。综合试验结果，烟叶唇柱苣苔不定芽生根的最佳温度为 28 ℃。【表6】

　　
　　3 结论与讨论
　　
　　在植物的离体培养过程中，适宜的光照强度和温度是培养中的细胞所必需的，其对培养物的生长发育影响很大。

　　不同植物试管芽苗对光照强度有不同的反应。试验结果表明，1 000~1 500 lx 的光照强度即可以满足烟叶唇柱苣苔叶片的离体培养需求，而各阶段最适宜的光照强度有所不同，其中叶片不定芽诱导的最佳光照强度为 1 000 lx，不定芽增殖培养最佳光照强度为 1 500 lx，1 000~1 500 lx 的光照强度适宜不定芽的生根培养，二者的诱根效果差异极不显着。本试验中，烟叶唇柱苣苔叶片的离体培养其不定芽的诱导、增殖和生根最佳温度均为 28 ℃，在该温度下，不定芽诱导率、芽的增殖倍数、生根率、平均生根条数及植株高度均为最高值，而且培养物的生长势最好。

　　参考文献
　　
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