MicroRNA 为一大类基因负性调控因子，参与了包括细胞分化、细胞凋亡等多种生理和病理过程。有越来越多的证据表明，在多种人类恶性肿瘤中 MiR-145具有抑癌作用。但是，MiR-145 在口腔癌发生过程中的作用仍不明确。本研究旨在研究口腔癌细胞 CAL27 与正常口腔黏膜细胞中 hNOK 中 MiR-145 的表达水平，并探究 MiR-145 表达水平的变化对口腔癌细胞 CAL27 增殖、凋亡等细胞生物学特性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 人口腔癌细胞 CAL27，人口腔黏膜角化细胞 hNOK 均从西安交通大学医学院生物实验中心获得。DMEM 培养基，胎牛血清购自杭州四季青公司，二甲基亚砜（DMSO）购自美国 Sigma 公司。转染试剂脂质体 Lipofectamin2000,细胞凋亡实验检测试剂盒，细胞周期实验检测试剂盒，购自美国 Invitrogen 公司，TRIzol试剂购自大连 TaKaRa 公司，逆转录试剂盒选自 Toyobo 公司，PCR 试剂盒选自Fermentas 公司，Bugle-Loop MiRNA 聚合酶链反应试剂盒购自上海 GenePharma 公司。
1.2 细胞培养 人口腔癌细胞 CAL27、口腔黏膜角化细胞 hNOK 置于 RPMI 1640培养基（含 100mL/L 胎牛血清（FBS）中在 37℃下常规培养。
1.3 RNA 提取和实时定量 PCR 利用 TRIzol 试剂从培养细胞中提取总 RNA。利用 PrimeScript 反转录试剂盒生成 cDNA，最终反应体积为 20μL，其中包含 500ngRNA、0.5μL PrimeScript RT Enzyme Mix 和 4μL 的 5 倍 PrimeScript 缓冲液及1μL 反转录引物。PCR 试剂盒进行实时定量 PCR 检测以评估 MiR-145 的表达。根据 2-ΔΔCt方法计算每份样本中所含 RNA 的相对量。引物序列：MiR-145 正向引物：5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAAT-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。
1.4 瞬时转染 口腔癌细胞 CAL27（1×106）置于 100mL/L 胎牛血清（FBS）的1640 培养液中，50mL/L CO2，37℃条件下培养。用Lipofectamin2000试剂将MiR-145和 MiR-145 对照序列分别转染至 CAL27 细胞，具体方法可参照 Lipofectamin2000操作手册。MiR-145 和 MiR-145 对照序列由上海 GenePharma 公司合成，其序列分别为 MiR-145：5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′。MiR-145 阴性对照物 5′-AGGUAGUGUAAUCGCCUUGTT-3′。阴性对照序列与人类基因组非同源。
1.5 细胞集落形成实验 在培养瓶中用含有胎牛血清的 RPMI 1640 培养液调待测细胞至 1×106个,培养 24h 后留取上清液，与含胎牛血清的 RPMI 1640 培养液按1:3 的比例混合，37℃培养箱中培养。用磷酸盐缓冲液（PBS）配置琼脂糖，105℃进行消毒 30min 后降温至 45℃。留取一份琼脂糖溶液至 10 份培养液中，混匀后加至 24 孔板中。0.8mL/孔。待软琼脂变硬后，将培养板置于 37℃和 50mL/L CO2下培养。2 周后，对集落进行照相，并在光学显微镜下进行细胞集落计数。
1.6 细胞周期分析 转染后 72h 收获细胞，并用 PBS（磷酸盐缓冲液）冲洗 2 次，然后置于冰上以 700mL/L 乙醇固定至少 30min。接着用碘化丙啶溶液（含有 50μg/mL 碘化丙啶、50μg/mL RNase A（核糖核酸酶 A）、1mL/L Triton-X 和 0.1mmol/LEDTA 进行细胞染色。利用流式细胞仪，根据 DNA 含量，通过 FACS 分析细胞周期。
1.7 细胞凋亡分析 将细胞由 miR-145 和阴性对照序列转染 24h，转染后于 48h收获细胞，并用 500μL 结合缓冲液进行再悬浮。在细胞悬液中加入 5μLAnnexin-V-FITC 和碘化丙啶，并于室温下培养 20min。在流式细胞仪上分析染色的细胞。
1.8 统计学分析 所有试验均重复 3 次。统计分析采用 SPSS 11.0 统计软件包。各数据以均数±标准差或百分数表示。根据数据特点各参数之间的比较选用 χ2检验或 t 检验。P<0.05 认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 CAL27 和 hNOK 中的 MiR-145 的表达 MiR-145 在正常口腔黏膜细胞hNOK 中的表达量显着高于口腔癌细胞 CAL27(0.809±0.124 vs. 0.397±0.141)(P<0.05，图 1)。
2.2 MiR-145 抑制 CAL27 细胞生长 通过集落形成实验，发现 MiR-145 对CAL27 细胞生长具有抑制作用。与 MiR-145 阴性对照序列转染细胞相比，MiR-145转染细胞的集落数量明显减少(179.2±28.7 vs. 91.6±23.6)(P<0.05，图 2)。
2.3 MiR-145 诱导 CAL27 细胞周期阻滞 肿瘤细胞的生长抑制通常与伴发的细胞周期阻滞以及细胞死亡通路激活有关。因此，我们研究了细胞周期阻滞和凋亡对于所观察到的 MiR-145 转染细胞生长抑制的促进作用。如图 3 所示，与对照组相比，MiR-145转染细胞后发生G1期细胞周期阻滞。G1周期百分比从(66.57±1.4)%增至(76.78±1.8)%，(P<0.05)。
2.4 MiR-145 诱导 CAL27 细胞凋亡 与 MiR-145 对照序列转染细胞相比，MiR-145 转染细胞中的凋亡（尤其是晚期凋亡）细胞数量增加(10.3±1.7)% vs.(5.6±1.1)%，P<0.05，图 4）。
3 讨 论
MicroRNA（MiRNA）是目前肿瘤研究领域的研究热点之一，已发现和注册的MiRNAs 已达数千种。大量的研究表明 MiRNAs 作为内源性非编码的小分子 RNA，参与并调控了细胞的增殖、凋亡及分化过程，作为原癌基因或抑癌基因参与肿瘤的形成与进展。MiR-145是MiRNAs大家庭中的一员，定位于5号染色体，长约4.09kb,是肿瘤发生发展中的一个潜在的保护性 MiRNA，可通过与靶基因 mRNA3,UTR 完全性互补或不完全性互补并降解靶基因 mRNA 或仅抑制其翻译过程，可显着影响肿瘤细胞的生长、侵袭及凋亡的过程。
关于癌细胞中 MiRNA 的表达谱变化及其在肿瘤发生中作用的研究越来越受到重视，初步证明乳腺癌、结直肠癌、胃癌、前列腺癌等患者血清具有特定的MiRNA 表达谱，而 MiR-145 在上述肿瘤中表达均明显下调，说明 MiR-145 作为肿瘤相关基因在其发生、发展中发挥着重要的作用。目前，MiR-145 在口腔癌发生、发展的相关研究中的报道较少。为了明确 MiR-145 对口腔细胞癌增殖、凋亡及细胞周期的影响，在本研究中，我们检测口腔癌细胞 CAL27 和正常口腔黏膜细胞 hNOK 中的 MiR-145 表达，并探究在口腔癌发生过程中 MiR-145 所发挥的生物学功能。我们的数据显示，与正常口腔黏膜细胞相比，口腔癌细胞 CAL27 中的MiR-145 表达显着下调，提示在口腔细胞癌的发病机制中 MiR-145 可能为潜在的抑癌因子。MiR-145 的表达下调或沉默可能会消除肿瘤抑制作用，从而有助于口腔癌发生。因此，我们检测了 CAL27 中 MiR-145 的假定肿瘤抑制功能。将 MiR-145通过脂质体瞬时转染至口腔癌细胞 CAL27，通过与对照组相比，观察其对细胞增殖、凋亡等特征的影响。在本研究中，CAL27 细胞中的 MiR-145 恢复表达抑制了细胞的集落形成，从而呈现明显的细胞生长抑制作用，同时 MiR-145 恢复表达诱导了细胞周期阻滞和凋亡，这进一步表明它具有肿瘤抑制功能。这些研究结果为后期进一步确定其下游基因及开展口腔细胞癌的靶向基因治疗提供了依据。
目前，口腔细胞癌的治疗仍采取以手术为主的方法。由于颌面部血供丰富，术后出现的复发和转移影响了肿瘤的预后。MicroRNA 介导的肿瘤分子靶向治疗将可能成为根治肿瘤的重要的发展方向。而 MiR-145 被认为是一种具有肿瘤抑制作用的 MiRNA，在肺癌、乳腺癌、骨肉瘤细胞、宫颈癌和膀胱癌等均呈低表达状态。
因此，通过上调 MiR-145 的表达，可能对肿瘤细胞生物学特性发挥重要的作用。有研究表明，上调乳腺癌细胞株 MCF-7、MDA-MB-468 和子宫内膜癌细胞 MiR-145的表达水平，可明显下调细胞间粘合蛋白 JAMA 和 actin 结合蛋白 fascin 的表达水平，抑制细胞的侵袭转移能力。通过上调 MiR-145 在乳腺癌细胞 TP53 的表达水平可促进其凋亡特性。上调 MiR-145 还可提高结肠癌细胞对化疗药 5-氟尿嘧啶的敏感性。本研究结果表明，上调 MiR-145 的表达对于口腔细胞癌的治疗亦存在一定的潜在空间。
MiR-145 作为肿瘤诊断的血清学标记物逐渐受到重视。目前，肿瘤的诊断及临床分期主要依赖于组织学及放射影像学方法。近期的实验研究表明，肿瘤组织的MiR-145 可在血清的标本中检测。其优点是获得标本简单、无创、易得并可避免内源性 RNA 酶的降解。已证明在多种恶性肿瘤患者中，其血清具有特定的 MiRNA表达谱。
综上陈述，对 MiR-145 应用于口腔癌的早期诊断及治疗的研究具有广泛的前景，对于 MiR-145 的分子表达及生物学意义的深入认识，确定其调控表达的分子机制，对于口腔癌乃至其他恶性肿瘤的诊治具有深远的意义。
参考文献：
[1] BARTEL DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell,2004, 116(2):281-297.
[2] DU L, PERTSEMLIDIS A. microRNAs and lung cancer:tumors and 22-mers[J].Cancer Metastasis Rev, 2010, 29(1):109-122.
[3] MELO SA, ESTELLER M. Dysregulation of microRNAs in cancer:playing withfire[J]. FEBS Lett, 2010, 585(13):2087-2099.
[4] GARZON R, CALIN GA, CROCE CM. MicroRNAs in cancer[J]. Annu Rev Med,2009, 60(1):167-179.
[5] CHO WC, CHOW AS, AU JS. MiR-145 inhibits cell proliferation of human lungadenocarcinoma by targeting EGFR and NUDT1[J]. RNA Biology, 2011, (8):1-7.
[6] PARPART S, WANG XW. microRNA regulation and its consequences in cancer[J].Curr Pathobiol Rep, 2013, 1(1):71-79.
[7] SACHDEVA M, MO YY. MicroRNA-145 suppresses cell invasion and metastasisby directly targeting mucin 1[J]. Cancer Res, 2010, 70(1):378-387.
[8] TAKAGI T, LIO A, NAKAGAWA Y, et al. Decreased expression ofmicroRNA-143 and -145 in human gastric cancers[J]. Oncology, 2009, 77(1):12-21.
[9] GOTTE M, MOHR C, KOO CY, et al. miR-145-dependent targeting of junctionaladhesion molecule A and modulation of fascin expression are associated withreduced breast cancer cell motility and invasiveness[J]. Oncogene, 2010,29(50):6569-6580.
[10] SPIZZO R, NICOLOSO MS, LUPINI L, et al. miR-145 participates with TP53 indeath-promoting regulatory loop and targets estrogen receptor-alpha in humanbreast cancer cell[J]. Cell Death Differ, 2010, 17(2):246-254.
[11] ZHANG J, GUO H, ZHANG H, et al. Putative tumor suppressor miR-145 inhibitscolon cancer cell growth by targeting oncogene friend leukemia virus integration 1gene[J]. Cancer, 2011, 117(1):85-95.
