瘢痕组织TGF-β1/Smad信号通路标志性因子蛋白和基因的检测

　　皮肤瘢痕的形成是由于机体炎症反应，胶原的合成与降解不平衡、异常粘多糖的出现以及纤维细胞的增生所造成。从广义上来讲，没有疤痕就没有创伤的愈合。疤痕组织的主要成分是纤维蛋白。疤痕组织胶原的产生和沉积增加了伤口的强度，从一般意义上来说是有益的。如果疤痕组织形成不充分，受损组织得不到正常的张力，由此可以引发许多并发症，如腹壁切口愈合的疤痕薄弱，在腹内压的作用下可使疤痕处重新裂开或腹内容物逐渐向外膨出而形成腹壁疝。相反，如果疤痕过度形成，就可造成严重的外形或功能上的重要问题。因而疤痕相对于损伤前组织来说，总是一个不完善的替换。从机械角度来看，其抗强性减弱;从营养角度来看，造成了氧和营养物质交流的障碍;从功能角度看，引起受损组织的畸形和功能障碍，从美观角度看，造成了外形的破坏。部分病理性瘢痕具有增殖性，其呈现持续生长亢奋表现，患者可出现瘙痒难忍甚至疼痛破溃出血等症状，病理性瘢痕不但影响患者的美观、生理功能，且在长期受压、持重、牵拉、摩擦、抓痒等不良刺激影响下有癌变可能。

　　创伤伤口愈合经过上皮化环节后，TGF － β 信号转导通路在成纤维细胞内被激活，使体内合成和分泌更多的 TGF － β1 受体，靶基因被持续性启动，又由于 TGF － β 信号传导通路与细胞基质沉淀以及纤维化密切相关，通路被过度激活后导致细胞外基质被过度沉淀，最终形成疤痕。在 TGF － β 信号转导通路上Smad 是该通路中药的细胞内信号转导因子，可将 TGF － β 信号从细胞表面受体传导至细胞核，笔者现将不同瘢痕组织标本进行 TGF － β1/Smad 信号通路标志性因子蛋白和基因的检测，以期为瘢痕癌治疗提供新的临床思路。

　　1 资料与方法
　　
　　1． 1 一般资料:标本来源于本院 2009 年 1 月至 2013 年 2 月病理科。20 份病理性瘢痕组织标本设为观察 A 组，其中男性 11例，女性9 例，年龄29 －81 岁，平均(42 ±5． 32)岁，来源部位:头面部 9 例，上肢 6 例，下肢 5 例，均有疤痕形成史。20 份标本均经过 HE 染色及光镜检查确诊为瘢痕癌;20 份瘢痕癌组织标本设为观察 B 组，其中男性 10 例，女性 10 例，年龄 30 －81 岁，平均(42 ±7． 11)岁，来源部位:头面部 8 例，上肢 7 例，下肢 4 例，臀部 1 例，疤痕形成原因:火烧伤 11 例，电击 2 例，油烫伤 7 例;20 份正常皮肤组织设为对照组，其中男性 11 例，女性 9 例，年龄31 －82 岁，平均(43 ±6． 91)岁，部位:头面部7 例，上肢8 例，下肢 3 例，臀部 2 例。三组标本在年龄、性别、来源部位等一般情况无统计学差异(P ＞0． 05)，具有可比性。

　　1． 2 检测方法

　　1． 2． 1 免疫组化
　　
　　1． 2． 1． 1 标本制作:采用 SP 法进行标本形态学的检测，标本脱蜡、水化后使用 PBS 洗 2 － 3 次各 5min，将 3% H2O2(80% 甲醇)滴加在 TMA 上，室温静置 10min，PBS 洗 2 －3 次各 5min;抗原修复;PBS 洗 2 － 3 次各 5min;滴加正常山羊血清封闭液，室温 20min。甩去多余液体。滴加Ⅰ抗 50μl，室温静置 1h 或者4℃ 过夜或者 37℃1h。4℃ 过夜后需在 37℃ 复温 45min。PBS 洗3 次各 5min;滴加Ⅱ抗 40 － 50μl，室温静置，或 37℃ 1h;Ⅱ抗中可加入0． 05%的 tween －20。PBS 洗3 次各5min;DAB 显色5 －10min，在显微镜下掌握染色程度;PBS 或自来水冲洗 10min;苏木精复染 2min，盐酸酒精分化;自来水冲洗 10 －15min;脱水、透明、封片、镜检。

　　1． 2． 1． 2 结果判定:TGF － β1 阳性表达是细胞核和细胞质均出现棕色颗粒，而 Smad 阳性表达是细胞质出现棕色颗粒;每张切片随机选择 5 个视野，统计着色细胞与未着色细胞的比值(阳性率)。根据阳性率 × 染色强度计分的乘积将免疫组化组织细胞阳性等级分为 4 个等级:阴性:积分 ＜2 分;弱阳性:积分波动于 2 －3 分之间;阳性:积分波动于 4 －6 分之间;强阳性:积分 ＞6 分。

　　1． 2． 2 Western blotting1． 2． 2． 1 试剂:SDS － PAGE 试剂盒购于碧云天生物技术有限公司，转膜缓冲液、膜染色液、包被液、显色液购于厦门鹭隆生物技术有限公司1． 2． 2． 2 提取蛋白和检测:取不同组别皮肤组织 200mg，利用蛋白酶抑制剂提取总蛋白。100℃ 金属浴中变性后，进行 SDS电泳(4%浓缩胶，12% 分离胶，120V，50mA，1． 5h)，用 PVDF 膜转印． 5%脱脂奶粉液的封闭 2h 后，分别加入抗 TGF － β1、Smad和 β － actin 抗体(1:1000)，4℃孵育过夜，次日加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔 IgG(1:2000)室温 2h。加入显色液，计算机扫描图像，并由生物图像分析系统 Bio － Rad 公司，Model Gel Doc2000，美国) ． 分析处理。

　　1． 2． 3 Real － time PCR
　　
　　1． 2． 3． 1 试剂
　　
　　1． 2． 3． 2 试剂:dNTP、Pfu 酶均购于上海生工生物工程有限公司;PCR 产物纯化试剂盒及质粒提取试剂盒均购自上海生工生物工程公司，基因组 DNA 提取试剂盒购自 Promega 公司。

　　1． 2． 3． 3 提取 RNA:三组组织的标本各 100mg 加入 500μL 的Trizol 试剂( Invtrogene 公司) 和 100μL 的氯仿，均匀混合后置于离心机进行 14000r/min 转速的离心 10min，将上层水相置于新的 EP 管后加入同等体积将 RNA 沉淀，干燥后加入 10μL 用DEPC 处理去离子水溶解 RNA 沉淀，置于 － 80℃ 保存。

　　1． 2． 3． 4 引物设计:针对国内 TGF － β1、Smad 的基因片段保守区域，根据美国基因库(GenBank)收录的基因序列，表 1 的引物由厦门鹭隆生物技术有限公司合成并标记，扩增 Ct 值利用lightcycler 荧光定量 PCR 仪配备软件进行分析。Real － TimePCR 操作方法按照试剂盒说明书，使用 GAPDH 作为内部参照，将 GAPDH 的拷贝数作为校正基数，通过 ABI7000 软件获得检测指标 Ct(cycle threshold)值，与同样本中 GAPDH 的 Ct 值相减，即获得该样本中相应指标的ΔCt 值。以对照组 ΔCt 值作为校正，软件根据 2 － ΔΔCT 数值计算得出检测指标基因浓度水平。PCR 扩增产物测序由厦门鹭隆生物技术有限公司完成。具体序列见表 1，【表1】

　　
　　1． 3 统计学处理:所得所有数据采用 SPSS18． 0 系统进行统计分析，图像分析所产生数据用(x珋 ± s)进行表示，实验结果采用单因素方差分析法进行分析描述，组间两两比较采用 LSD 法进行，用等级相关(Spearman)分析变量之间的相关性，以 α =0． 05作为检验水准，P ＜0． 05 认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2． 1 TGF － β1 的蛋白表达:TGF － β1 阳性表达表现为细胞核和细胞质中均有棕黄色颗粒，正常皮肤、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌中的表达分别为阴性、弱阳性和强阳性，其表达水平、表达强度在三者之间有差异(FPA = 165． 93，FOD = 98． 65，P ＜ 0．01) ，观察 B 组蛋白表达水平高于观察 A 组和对照组 ( P ＜ 0．05)，观察 A 组和对照组之间蛋白表达水平无统计学差异(P ＞0． 05) 。进行 Western blotting 检测后发现正常皮肤、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌三组 TGF － β1 的蛋白灰度值的表达水平呈递增式(FPA =113． 25，P ＜0． 01)，观察 B 组蛋白表达水平高于观察A 组和对照组( P ＜ 0． 05)，观察 A 组和对照组之间蛋白表达水平无统计学差异(P ＞0． 05)。具体见图 1，图 2。【图略】
　　
　　2． 2 Smad 的蛋白表达:Smad 阳性表达表现为细胞质中均有棕黄色颗粒，正常皮肤、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌中的表达分别为弱阳性、阳性和强阳性，其表达水平、表达强度在三者之间有差异(FPA =99． 94． 93，FOD = 78． 49，P ＜ 0． 01)，观察 B 组蛋白表达水平高于观察 A 组和对照组(P ＜0． 05)，观察 A 组和对照组之间蛋白表达水平无统计学差异(P ＞ 0． 05)。进行 Westernblotting 检测后发现正常皮肤、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌三组Smad 的蛋白灰度值的表达水平呈递增式( FPA = 102． 89，P ＜0． 01)，观察 B 组蛋白表达水平高于观察 A 组和对照组(P ＜0．05) ，观察 A 组和对照组之间蛋白表达水平无统计学差异( P ＞0． 05) 。具体见图 3，图 4。

　　2． 3 Real － Time PCR 结果:观察 B 组 TGF － β1、Smad 基因表达水平高于观察 A 组和对照组(P ＜0． 05)，观察 A 组和对照组之间 TGF － β1、Smad 基因表达水平无统计学差异(P ＞ 0． 05)，见表 2。【表2】

　　
　　2． 4 皮肤瘢痕癌中 TGF － β1、Smad 表达的相关性:经过 Pear-son 相关分析，在皮肤瘢痕癌标本中 TGF －β1 与 mRNA TGF －β1(r =0． 727 P ＜0． 01)，Smad 与 mRNA Smad(r = 0． 812 P ＜ 0．01) 的表达均呈正相关。

　　3 讨 论

　　皮肤受损后愈合要经历炎症期、肉芽组织形成期和瘢痕形成期，在此修复过程中 TGF － β 全程参与。皮肤受损后机体应激反应趋势大量血小板脱颗粒在伤处聚集，随后 TGF － β 对大量单核细胞、中性粒细胞和成纤维细胞产生趋化作用，随之大量单核细胞、中性粒细胞和成纤维细胞被趋化至皮肤伤处，TGF－ β 通过自分泌的细胞因子调节方式维持其在有效作用的浓度范围内;另一方面，TGF － β 还可超化炎性细胞和成纤维细胞，超化炎性细胞在伤口聚集，可促进细胞生长因子的分泌，而超化成纤维细胞，可达到刺激多种基质蛋白胶原基因的转录，两者均可达到愈合伤口的最终目的。

　　经过分子生物学大量研究发现，TGF －β1/Smad 信号通路能抑制和分化角质细胞，角质细胞分泌的角质细胞生长因子对组织损伤具有明显的促进修复和保护作用，TGF － β1/Smad 信号通路在一定程度上削弱了角质细胞修复组织的作用，AnnesJP等对烧伤小鼠进行观察，发现 Smad3 基因敲除的小鼠体内的角质细胞分裂更快，烧伤创面感染率下降，伤口愈合恢复更为迅速，这一结果提示 TGF － β 信号通路通过 Smad 蛋白抑制角质细胞的增殖而影响伤口组织愈合。加快伤口创面重上皮化过程，减少基质的沉淀和炎性细胞的浸润，可减少伤口愈合过程中肉芽组织的形成数量，这是伤口愈合的理想方式。

　　在多数人类肿瘤患者中存在 TGF － β 受体和 Smad 基因的过度表达的现象，有报道认为 TGF － β 蛋白的增殖与皮肤癌的发生发展息息相关，TGF － β 受体蛋白的表达水平和表达强度是评估皮肤肿瘤程度的一个标志性分子生物因子，本研究结果显示，瘢痕癌患者的 TGF － β 蛋白和基因的表达水平和表达强度均高于正常皮肤组别和病理性瘢痕组，且差异具有统计学意义(P ＜ 0． 01)，说明 TGF －β受体的蛋白和基因在瘢痕癌标本中的高表达可能与瘢痕癌的发生相关，其发生机制可能与TGF － β1 影响组织纤维化进程的特质相关:TGF － β1 可诱导细胞外基质产生沉淀，其中最为明显的是刺激成纤维细胞而导致粘连蛋白基质的沉积，另一方面 TGF － β1 可降低蛋白酶的活性，抑制细胞外基质的降解过程，导致肉芽组织大量形成而促进病理性瘢痕形成，而后恶化成瘢痕癌。

　　Smad 是 TGF － β 信号转导通路的标志性蛋白，Smads 家族蛋白在将 TGF － β 信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，TGF － β1 对细胞进行刺激后，TGF － β1 型受体被磷酸化，与下游的 Smad2/Smad3 相互识别编码后被活化，与此同时与 Smad4 结合成由异源寡聚体形成的复合体，继而发生核转移，从细胞质转移到细胞核后启动靶基因，促进靶基因的启动和转录。2006 年 Haiyan 等使用蛋白免疫印迹法和RT － PCR 法观察 TGF － β1 刺激细胞周期以及对其下游 Smad蛋白家族因子基因的表达影响，发现瘢痕疙瘩细胞模型的 Smad基因表达量高于正常模型细胞组别，提示了 TGF － β1 促进细胞外基质过度表达而导致瘢痕的途径。本研究结果显示，瘢痕癌患者的 Smad 蛋白和基因的表达水平和表达强度均高于正常皮肤组别和病理性瘢痕组，且差异具有统计学意义(P ＜0． 01)，说明 Smad 的蛋白和基因在瘢痕癌标本中的高表达可能与瘢痕癌的发生相关。这一结果与 Haiyan 等所得结论一致。在相关性分析中我们发现 TGF － β1、Smad 的蛋白和基因的表达均升高，且两者呈正相关关系，说明在皮肤瘢痕癌的发生过程中，TGF －β1、Smad 发挥了协同作用，再者，由于 TGF － β1、Smad 是 TGF －β1/Smad 信号通路的标志性因子，故笔者认为瘢痕癌的发生过程中，TGF － β1/Smad 信号通路具有重要关系，应作为治疗的新思路，对烧伤后瘢痕的预防提出新方法提供靶方向。