探讨肺腺癌组织mRNA在信号通路中的调控作用

　　肺腺癌是肺癌当中最常见的一种，也是死亡率很高的一种癌症，通常5年生存率只有15%[1].通过对肺腺癌发生与进展中一些关键信号通路的研究，可以帮助寻找到高效的分子靶向抗癌药物。我们利用全基因组表达谱芯片，筛选肺腺癌与癌旁组织中差异表达的mRNA,并分析其参与的信号通路变化，探讨mRNA在信号通路中的调控作用。

　　1材料与方法
　　
　　1.1标本来源
　　
　　所有6例肺腺癌组织标本均来源于2010年4月到2011年5月武汉大学中南医院胸心外科手术切除标本，所有病人标本均为术前未行放疗或化疗，术后病理确诊为肺腺癌的肿瘤组织（T）和癌旁正常组织（N）的液氮冻存标本。所有标本采集均经过患者家属签属知情同意，并经医院伦理委员会审核通过。所有标本均于肿瘤离体后15min内获取。

　　1.2一般材料
　　
　　TRIzol试剂（Invitrogen生命科技公司），ds-cDNA合成试剂盒（Invitrogen生命科技公司），单色DNA标记试剂盒（美国NimbleGen公司），含有19 000条mRNA的全基因组表达谱芯片（上海康成生物技术公司）。

　　1.3实验方法
　　
　　①RNA制备使用TRIzol试剂相位分离并提取组织总RNA.

　　②RNA含量和质量控制：使 用 紫 外 光 吸 收 测 定 法，利 用NanoDropND-1000测定RNA浓度和纯度。使用变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

　　③双链cDNA合成、洗脱及析出：使用Invitrogen试剂盒，按照说明书将提取的5μg总RNA合成为ds-cDNA.加入4μg的RNA酶A溶液，轻度振荡后在37 ℃下孵育10min,向含有RNA酶A的ds-cDNA中加入163μl苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液，涡旋机上涡旋。将上述试剂转移到相位锁定管中，12 000 g下离心5min.

　　小心转移上清液至干净的1.5ml离心管中，即得到无RNA的ds-cDNA.以冷无水乙醇析出沉淀并用NanoDropND-1000定量。

　　④样品标记：将1吸光度单位的Cy3-9荧光素加到1μg双链cDNA中，98℃下孵育10min.加入100pmol dNTP和100U克列诺片段并混匀，37 ℃孵育2h,加入0.1体积EDTA终止反应，异丙醇纯化已标记的ds-cDNA.

　　⑤杂交和洗涤：取4μg已标记ds-cDNA加入Nim-bleGen杂交缓冲液，于42 ℃下在杂交系统中反应16-20h.之后用冲洗缓冲液洗涤。

　　⑥扫描结果：Axon GenePix 4000B扫描杂交后所得芯片，Gene-Pix pro V6.0读取原始图像。所得图像输入Nim-bleScan software（version 2.5）进行表达数据分析，用分位数和强多芯片平均法对基因表达数据进行归一化。所有mRNA数据由Agilent GeneSpring GX软件进行进一步分析。对基因表达数据进行非监督分层聚类分析（Unsupervised Hierarchical Cluste-ring），并对基因进行信号通路分析。

　　2 结果
　　
　　2.1总RNA、ds-cDNA与标记DNA的质量与纯度
　　
　　通 过NanoDropND1000分 析，6组 样 品 中 总RNA、ds-cDNA与标记DNA的OD260/OD280Ratio值均在1.8-2.0之间，OD260/OD230Ratio值均大于1.8（表1）。琼脂糖凝胶电泳示总RNA的28S、18S条带清晰，且28S条带亮度在18S条带的两倍以上，5S条带模糊。该结果显示所得RNA质量和纯度可满足实验要求，用于下步实验。
　　
　　2.2 mRNA非监督分层聚类分析
　　
　　图1显示，依据mRNA的表达情况，6例标本被分为两大类，与肺癌组织和癌旁组织的分类相符，说明差异表达的mR-NA具有肿瘤组织特异性，即有大量的mRNA在肿瘤中发生了高表达或低表达。2.3 mRNA在肿瘤组织中的差异表达情况==在mRNA火山图（图2）中，以T-test显着检验P值的负对数-log10（P-Value）为纵坐标，以log2（倍数变化）为横坐标。则图中红点表示在统计学上为差异表达2倍以上且P<0.05的mRNA.

　　检测后发现，发现发生显着差异表达（大于2倍变化且P<0.05）的mRNA共832条，其中T相对N高 表 达 的mRNA 407条。 基 因 序 号 为NM-006926的mRNA在肿瘤中的表达量为正常组织中的58.69倍（P=0.026），序列号为NM-000900的mRNA在 肿瘤组织 中的表达量为正常组 织 中 的43.69倍（P=0.026），序列号为NM-138455的mR-NA在肿瘤组织中的表达量为正常组织中的28.75倍（P=0.038）。表2列举了相对高表达的407条mRNA中的20条的情况。

　　T相对N低表达的mR-NA有425条。其 中 基 因 序 号 为NM-057182的mRNA在 癌旁组织 中的表达量为肿瘤组 织 中 的17.49倍（P=0.023），序号为NM-002639的mRNA在癌旁组织中的表达量为肿瘤组织中的15.85倍（P=0.049），序号为NM-153246的mRNA在癌旁组织中 的 表 达 量 为 肿 瘤 组 织 中 的10.52倍 （P =0.023），序号为NM-214462的mRNA在癌旁组织中的表达量为肿瘤组织中的10.33倍（P=0.0231表3列举了相对低表达的425条mRNA中的20条的表达情况。2.4信号通路分析==信号通路分析有助于研究者寻找在肿瘤中发生显着变化的信号通路，并进一步探索其中被调节的基因和蛋白。分析软件将所检测到有统计学意义的差异表达mRNA与信号通路库（KEGG）对比扫描，富集度分析发现有9种信号通路中的基因或蛋白发生了上调或下调表达（图3）（P<0.05）。我们选择认为与NSCLC相关的5条信号通路进行描述。

　　2.4.1同源重组信号通路Rad50、Rad54和DNA聚合酶δ（polδ）表达下降。

　　2.4.2人转化生长因子-β信号通路凝血酶敏感素1基因（thrombospondin-1,THBS1）表达上调，smad锚着受体激活蛋白（Smad anchor for receptoractivation,SARA）表达下降。
　　
　　2.4.3丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路FGF、RasGFR、Rap1、FLNA、HSP72、NFAT-4和JunD等表达上调；CACN、Cap1m、IKK、MNK1/2、MKP（MAPK phosphatase,MAPK磷 酸 酶 ）、GLK、JNK、MKP和MSK1/2表达下降。

　　2.4.4细胞周期信号通路Cdc14和磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸结合蛋白等基因表达上调；细胞周期蛋白E（CycE），细胞周期蛋白依赖激酶1（CDK1），起始识别复合体（origin recognition complex,ORC）、微小 染 色 体 维 持 基 因 （mini-chromosome mainte-nance,MCM）,Chk1,2,BubR1,Cdc25B,C等表达下降。

　　2.4.5 p53信号通路IGF表达上调；周期蛋白E和Cdc2、Maspin表达下降。

　　3 讨论
　　
　　肺癌是人类最常见的致死性恶性肿瘤。肺癌的发生有多种蛋白质编码基因和调控基因的参与，目前对肺癌的编码基因已经有了较为深入的了解，但对肺癌的调控网络还需要进一步研究[2,3].运用高通量人类基因表达谱芯片检测样品中的基因表达情况，随后对其进行基因语义分析、信号通路分析等，有助于分析肺癌的调控网络，进而寻找到高效抗癌靶向药物。这也是目前常用的一种癌症研究方法。

　　在本次试验中，我们收集了6例肺腺癌肿瘤标本，采用高通量全基因组基因芯片，筛选出差异表达（大于2倍变化且P<0.05）的mRNA共832条。

　　其中T相对N高表达的mRNA 407条，T相对N低表达的mRNA有425条。这些差异表达的mR-NA分子可能通过被激活或抑制，改变了一些肿瘤相关信号通路的作用，进而促进了肺腺癌的发生与发展。通过分层聚类分析，我们发现了差异表达的mRNA分类与肺腺癌和癌旁组织分类相符。这也从另一个角度证明了差异表达的mRNA与肺腺癌发生的相关性。差异基因中有的是控制癌变的驱动基因，有的是驱动基因下游基因，筛选并确认驱动基因有待进一步工作完成。

　　通过对这些差异表达的mRNA与信号通路库（KEGG）进行对比扫描，我们发现与肺腺癌发生过程中关系比较密切的5条信号通路，并对一些关键性的差异表达基因在5条信号通路中的作用进行初步分析。如在人转化生长因子-β信号通路中，凝血酶敏感素1（Thrombospondin-1,THBS1）可以作为TGF-β通路的起始刺激物上调癌细胞的uPA和PAI1基因表达，还能与TGF-β共同作用于金属蛋白 酶 并 影 响 其 活 性。 本 研 究 发 现 在 肺 腺 癌 中THSB1的表达上调，提示其可能通过激活了TGF-β通路而促进肺腺癌的发生；在p53介导的细胞周期停止进程中，细胞周期蛋白E的表达是该过程正常进行的必要条件之一，CycE在细胞周期中的主要作用是促进细胞G1期的进展，同时还在细胞凋亡中起正性调 节 作 用。本 研 究 结 果 显 示 在NSCLC中，CycE的表达下降，使p53抑制肿瘤细胞周期进展的作用失败，引起了肿瘤细胞的增殖。通过我们的分析工作，一方面为将来寻找肺腺癌的靶向治疗提供了捷径，另一方面也为其他研究癌症信号通路的工作者提供了丰富的研究素材。

　　另外，我们之前已通过高通量基因芯片，研究了肺腺癌与癌旁组织标本中长链非编码RNA（longnon-coding RNA,lncRNA）的 差 异 表 达 情 况[4,5].

　　结合本次的实验结果，我们可以得到一些新的启示：

　　lncRNA作为一种调控基因，可以通过对mRNA编码基因的调控作用，促进肺腺癌的发生。在本次发现的与肺腺癌发生密切相关的5个信号通路中，一些差异表达的mRNA分子，无论是在位置和作用功能上，均与上次芯片分析所得的差异表达lncRNA结果相偶合。结合两次芯片分析结果，我们产生了一些这样的假设：如在同源重组信号通路中，最上游的Rad50被某一lncRNA调控后表达受到抑制，进而引起下游Rad54和DNA聚合酶δ表达的下调。

　　另外，也可能存在其他的一些lncRNA分子，通过抑制DNA聚合酶的 活性或 调 整 其 构 象，进 而 导 致DNA聚合酶δ的下调 表达；在p53信号通路中，Maspin的表达下降受IncRNA的调控，之前已有研究发现了Maspin的受p53依赖和非p53依赖的表观遗传学调控[6].因此我们认为，在肺腺癌的发生中，Maspin的抗血管生成和抗转移作用被抑制可能与lncRNA的表观遗传调节作用有关。

　　参考文献
　　
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　　[3] 周雪峰，王乐，张力，等.N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ在CD133+人肺腺癌细胞中的表达和功能研究[J].武汉大学学报：医学版，2011,32（5）:589-592.
　　[4] 周雪峰，但攀，朱明林，等.肺腺癌组织与肺癌组织长链非编码RNA表达谱的筛选[J]1中华实验外科杂志，2012,29:1 489-1 490.
　　[5]Zhang Li,Zhou XF,Pan GF,et al.Enhanced expres-sion of long non-coding RNA ZXF1promoted the inva-sion and metastasis in lung adenocarcinoma[J].BiomedPharmacother,2014,68（4）:401-407.
　　[6]Van Poppel H,Haese A,Graefen M,et al.The rela-tionship between Prostate Cancer gene 3（PCA3）andprostate cancer significance[J].BJU Int,2012,109（3）：360-366.