芽孢杆菌防治植物病害的机理及研发问题探究

　　长期以来，植物病害的防治主要以化学农药为主，化学农药对农业生产上防治病虫害起了十分重要的作用，但长期不合理使用化学农药产生了诸多问题。如化学农药不仅对人、畜的健康造成危害，而且对土壤、水体、大气造成严重污染，破坏了生态平衡；病原菌和害虫抗药性的不断增强，农药的使用量和使用频度不断加大，出现了用药量与病虫害相互递增的恶性循环。因此开发对人类和环境友好、并具良好防治效果的新植物病虫害防治策略尤为重要[1].

　　随着人们对食品安全的日益重视和可持续控制病虫害发展的需要，生物防治受到各国政府和植物保护专家的重视。生物防治是以生态学为基础来控制有害生物，是综合防治体系中一个必不可缺少的组成部分。

　　生物防治避免了化学农药使用带来的一系列植保、环境和能源方面的问题，促进了环境生态平衡和农业的可持续发展。植物微生态学理论认为[2]:存在于植物体表或体内的微生物群落是一个动态平衡的生态系，一旦平衡打破，则发生植物病害；植物病害生物防治是在被病原物占据主导的生态系中引入有益的微生物，形成不利于病原物生长而利于植物生长的新的动态平衡体系，从而控制病害发生和发展。近年来随着分子生物学技术、发酵工程和生物信息工程等新技术的飞速发展，为生物农药的研发应用奠定了坚实的理论基础和可靠的技术路线。

　　芽孢杆菌作为重要的生防资源，具有广阔的应用前景。利用芽孢杆菌防治植物病害，国内外报道较多[3-7].

　　芽孢杆菌在生长过程中可以在寄主植物根、叶围定殖，与病原菌竞争营养和侵染位点；分泌抗菌物质、抑制病原菌生长；诱导植物产生系统抗病性、抵御病原菌入侵，从而达到生物防治的目的。同时，芽孢杆菌能够产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的芽孢，所以是理想的生防菌筛选对象。许多性状优良的芽孢杆菌菌株已成功应用于植物病害的防治。本文就芽孢杆菌类生物杀菌剂的研发现状、芽孢杆菌防治植物病害的机理以及在实践应用中存在的问题进行简要综述。

　　1 芽孢杆菌类生物杀菌剂的研发现状

　　芽孢杆菌 Bacillus spp.是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏染色阳性、产芽孢的杆状细菌。芽孢杆菌产生的芽孢，有较强的抵抗干燥、热和紫外线辐射等外界环境压力的能力，同时芽孢杆菌种群中有许多具有特殊功能的菌株，所以在工业、农业、医学和食品加工等领域中有广泛的应用价值[8,9].由于生防芽孢杆菌具有抑制多种植物病原菌的能力，并且是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，对环境友好，因此，备受国内外植物保护和环境保护专家的青睐。目前，生防芽孢杆菌广泛应用于植物根部、枝干、叶片以及果蔬采后病害的防治上[10-13].

　　1.1 国外生防芽孢杆菌的应用现状

　　美国已有 3 株枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 和 1 株解淀粉芽孢杆菌 B. amyloliquefaciens 获得环保局（EPA）商品化生产应用许可，进入大面积推广应用，并取得较好的销售业绩。枯草芽孢杆菌 GB03 商品名为 Kodiak,由 Gustafson 公司研发，主要应用于土传真菌病害防治，特别是棉花和大豆的种子处理，在美国市场的销售良好。枯草芽孢杆菌 MBI600 商品名为 Subtilex,由 Microbio Ltd 公司研发，主要通过根部使用或拌种防治由镰刀菌、曲霉菌等引起的豆类、棉花和花生的根部病害。枯草芽孢杆菌 QST713 商品名为 Serenade,由 Agra Quest 公司开发，能同时防治由真菌和细菌引起蔬菜和水果的叶面病害。解淀粉芽孢杆菌 FZB42 和枯草芽孢杆菌 GB122 混用制成的杀菌剂商品名为 BioYield,由 Gustafson 公司研发，应用于防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等病害。德国将解淀粉芽孢杆菌 FZB42用于微生物肥料，解淀粉芽孢杆菌 CECT 5940 作为饲料添加剂。澳大利亚开发的 B. subtilis A-13 对麦类和胡萝卜立枯病以及其他土传病害具有很好的防治和增产作用。日本东京技术研究所的枯草芽孢杆菌 RB14和 NB22 分别对立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 和青枯菌 Pseudomonassolanacearum 引起的番茄病害有良好的防效。

　　1.2 国内生防芽孢杆菌的研发概况

　　国内科研工作者对具有生防作用的芽孢杆菌进行了广泛的研究。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已开发出一批生防作用优良的枯草芽孢杆菌菌株如 Bs-916、B908、B3、B903、BL03、XM16、BII、PRs5、ZH-2.江苏省农业科学院植物保护研究所陈志谊等[14,15]筛选获得的菌株 Bs-916 对多种病原真菌和水稻白叶枯病菌都有显着抑制作用，自从 1991 年至今对水稻纹枯病田间防效稳定在 60%~81%,累计推广应用面积达 800 万 hm2.南京农业大学[16]生防菌 B3（商品名麦丰宁）对小麦纹枯病田间防效 50%~80%.云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药"百抗"（10 亿孢子/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂），已获得农业部登记注册，累计推广面积约 4667 hm2,主要防治水稻纹枯病、三七根腐病、烟草黑胫病。林东等[17]发现枯草芽孢杆菌 SO113 对水稻白叶枯病菌具有强烈的抑菌作用。胡剑等[18]从枯草芽孢杆菌 BS-98 中分离纯化抗真菌蛋白，发现该抗菌蛋白对苹果轮纹病、芦笋枯萎病具有很强的抑制作用。顾真荣等[19]评估显示枯草芽孢杆菌 G3 对菜豆和茄子苗期炭疽病、菌核病以及番茄叶霉病均具有很好的防效。不同生防菌株的抑菌谱、抑菌作用及机理等有较大差异。如从丝瓜根际土壤分离到的枯草芽孢杆菌 TG26[20],对小麦赤霉病和西瓜枯萎病有较强的抑制作用，对小麦赤霉病的盆栽防效达 89.8%,对西瓜枯萎病的苗期防效达 100%.张荣胜等[21]筛选到一株解淀粉芽孢杆菌 Lx-11 在田间防治细菌性条斑病菌上防效达 60.2%,显着高于化学药剂 20%叶枯唑的防效。王奕文等[22]从甜瓜表面分离到 1株解淀粉芽孢杆菌，对灰葡萄孢、链格孢、尖孢镰刀菌、黑曲霉和粉红单端孢等 8 种果蔬采后病原真菌具有广谱的拮抗作用；陈士云等[23]从土壤中分离到 1 株解淀粉芽孢杆菌 CH22,对油菜盘核菌具有强烈的抑制作用；欧雄常等[24]
从红树内生细菌中分离到 1 株能够拮抗辣椒疫霉病的解淀粉芽孢杆菌 RS261,喷施RS261 后 6 d 的防效大于 80%,9 d 的防效为 60%.

　　截止到 2014 年 12 月，我国芽孢杆菌类生物杀菌剂已经完成农药登记的生防芽孢杆菌的种类有 5 种；产品共有 59 个，产品的剂型主要有水剂、可湿性粉剂和悬浮剂 3 种（表 1）。

　　2 芽孢杆菌防治植物病害的机理

　　关于芽孢杆菌的防病促生作用机制，国内外学者进行了大量研究。普遍认为芽孢杆菌生防机制主要有营养和空间位点竞争，分泌抗菌物质，溶菌作用，诱导植物抗病性等方面。芽孢杆菌生防效果体现是以上几种方式共同作用的综合效果。

　　2.1 营养与空间位点竞争作用

　　营养和空间位点竞争指存在于同一个微生态环境中的 2 个或 2 个以上微生物之间对空间、营养、氧气等进行竞争的现象。营养竞争是生防芽孢杆菌在微生态环境中与其他微生物（包括病原菌）在其定殖部位争夺可利用营养物质，这些物质包括微生物生长发育必需的氨基酸、无机盐、碳水化合物维生素等。铁离子是微生物在繁殖过程中必需的营养成分之一，微生物通过分泌嗜铁素来获取环境中的 Fe3+,通过微生物特异性受体转运到细胞内满足自身需要[25].缺铁环境下，生防芽孢杆菌能产生铁的螯合物或铁载体，通过螯合土壤环境中 Fe3+使得病原菌可利用的 Fe3+大量减少从而抑制病原菌生长[26,27].空间位点竞争是生防芽孢杆菌在植物根际、体表或体内以及土壤中与病原微生物相互作用，尤其是病原菌侵入位点的争夺。Bacon等[28]从玉米体内分离的内生芽孢杆菌与玉米病原真菌串珠镰刀菌 Fusarium moniliforme Sheldon 具有相同的生态位点，生防芽孢杆菌能在玉米体内迅速定殖和繁衍，因而有效降低串珠镰刀菌及其毒素的积累。黎起秦等[29]

　　发现菌株 B47 主要是在番茄维管束中定殖，从而抑制番茄内生病菌的生长。芽孢杆菌在植物根、叶围的定殖能力决定了其与病原菌在营养与空间竞争的优势地位，是其发挥植物病害生物防治作用的重要机制之一。2004 年 Bais 等[30]

　　通过绿色荧光标记枯草芽孢杆菌 6051 和红色荧光标记病原菌丁香假单胞杆菌 P. syringae,系统研究了枯草芽孢杆菌与病原菌在植物根部的竞争作用，结果表明，枯草芽孢杆菌 6051 能很好地在植物根部定殖，形成一层生物膜，并成功地抑制丁香假单胞杆菌的繁殖，从而达到较好的生物防治效果。2013 年 Zeriouh 等[31]通过绿色荧光标记枯草芽孢杆菌 UMAF 在甜瓜叶面的定殖情况，枯草芽孢杆菌 UMAF 在叶面形成不成熟的生物膜，存活下来；待病原菌破坏了植物组织，植物叶面释放出更多的营养物质，比如蛋白质、多糖和核酸等细胞物质，枯草芽孢杆菌利用这些物质进行繁殖和形成生物膜，保护植物的病斑组织。枯草芽孢杆菌 UMAF 能在甜瓜叶面成功定殖，是其能有效防治由病原真菌 Podosphaera fusca 和病原细菌 Pectobacterium carotovorum 引起的甜瓜叶面病害的重要因素[32].

　　进一步深入研究发现，枯草芽孢杆菌 UMAF 在叶面定殖，主要归功于其分泌的脂肽类抗生素表面活性素激活枯草芽孢杆菌 TasA 蛋白和 EPS 多糖基因的表达，从而形成了成熟的生物膜[33-35].芽孢杆菌在植物根、叶围的成功定殖，是芽孢杆菌的一种多细胞行为，这种行为是多个基因、多种信号物质协同控制的结果[36,37].对芽孢杆菌定殖能力的进一步深入研究，有利于我们更加理解这种行为，也将为我们进一步利用芽孢杆菌防治植物病害提供理论基础。

　　2.2 分泌抗菌物质

　　自 1945 年 Johnson 和 Campbell[38]报道枯草芽孢杆菌分泌抗菌物质以来，目前人们从芽孢杆菌的不同菌株中发现 60 多种抗生素。这类次生代谢产物除了对病原真菌、细菌、病毒有抑制作用外，对芽孢杆菌生物膜形成、诱导植株产生抗病性均有影响。这些抗菌物质是芽孢杆菌抑制其他微生物生长、维持生态竞争能力的重要武器。通常具有优良防治效果的芽孢杆菌，其基因组有4%~5%的核酸序列用于抗菌代谢产物的合成，能合成多种抗菌产物，这些抗菌代谢产物能够抑制病原真菌和细菌的生长繁殖。

　　2.2.1 芽孢杆菌产生的抗生素 生防芽孢杆菌分泌产生的抗生素，根据生物合成途径分为两大类：1）由核糖体途径合成的小分子物质；2）由非核糖体途径酶系统合成的多肽类物质和其他一些活性物质。目前，非核糖体途径合成的抗生素研究比较深入，主要包括脂肽类化合物、聚酮类化合物、多肽类化合物和其他抗菌活性物质。

　　脂肽类化合物的理化性质较为稳定，对氯仿等有机溶剂有一定的耐受力，抗紫外线，对蛋白酶类的处理不敏感[39].根据其结构上的差异主要分为 3 大类：表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和泛革素（fengycin）。

　　表面活性素（surfactin）是由枯草芽孢杆菌所产生的晶状表面活性剂，其分子量约为 1 KDa,化学结构为含有 7 个 α-氨基酸和具有 13、14 或 15 个碳原子的 β-羟基脂肪酸交联形成内酯环状极性分子类化合物，具有很强的溶血活性，表现出抗病毒、抗肿瘤、抗支原体、一定程度的抗细菌活性[40].其作用机理是通过与生物膜的主要成分磷脂双层分子相互作用形成离子通道，破坏脂膜结构，使细胞内容物释放，引起细胞死亡[41];同时 surfactin 能有效降低植物根部表面张力，有利于生防菌的游动性和生物膜的形成，生物膜能有效保护植物根部免受病原菌的入侵[42-44].该家族主要包括枯草芽孢杆菌产生的表面活性素（surfactin）、短小芽孢杆菌产生的表面活性剂（pumilacidin）、地衣芽孢杆菌产生的地衣芽孢杆菌素（lichenysin）等。