芽孢杆菌防治植物病害的机理及研发问题探究(2)

　　伊枯草菌素（iturin）是一类强烈抑制真菌生长的脂肽类化合物，家族成员包括 iturin A、B、C、D、E,bacillomycin D、F、L、LC 和 mycosubtilin 等，都是由 7 个 α-氨基酸与 14~17 个碳原子的 β-氨基脂肪酸链相连而成[45,46].伊枯草菌素具有溶血活性，表现出强烈的拮抗真菌的能力，对细菌的拮抗能力也有报道，如藤黄微球菌 Micrococcus luteus.Bacillomycin D 具有很强的广谱抑制真菌的效果和微弱的抑制细菌的活性[47-50].Iturin 类家族拮抗真菌机理是通过影响真菌细胞膜的表面张力，导致微孔的形成、促使电解质及其他重要离子的渗漏，最后引起细胞死亡。

　　泛革素（fengycin）是一种能抑制多种丝状真菌生长的脂肽类抗生素，主要包括 fengycin A 和 B 两大类，是由 10 个 α-氨基酸肽与 β？羟基饱和或非饱和脂肪酸链（C14?C18）形成内酯环[51].泛革素的溶血作用没有表面活性素和伊枯草菌素的强烈，但是具有广谱的抗真菌活性和微弱的抑细菌活性[52].特别是对丝状真菌有很强的抗菌活性[53].

　　聚酮化合物是由低级脂肪酸聚合形成的具有长碳链结构的另一大类天然产物，芽孢杆菌也可以产生聚酮类化合物，主要包括 difficidin、macrolactin 和 bacillaene,这些物质具有强烈的抑制细菌的作用[54-56].聚酮化合物可以分为两大类：复合聚酮化合物和芳香族聚酮化合物。复合聚酮化合物是低级脂肪酸在缩合反应后经过内酯化成环而产生的一组分子，包括大环内酯类（如红霉素）等抗生素。芳香族聚酮化合物是低级脂肪酸在缩合反应后保持非还原状态、经过折叠和醇醛缩合形成的，包括蒽环类（如多柔比星）等抗生素。目前，对于聚酮类化合物的生物合成途径研究较多，但其抑制细菌的作用机理尚不十分明确。

　　除脂肽类抗生素和聚酮类化合物之外，生防芽孢杆菌分泌的抗生素还包括分枝环肽类、二肽类、线状聚酰胺物和多肽类物质等。其中由蜡质芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌产生的线状聚酰胺物 zwittermicin A,对原核生物和真菌具有广谱的抑菌活性。分枝状环肽化合物主要包括 polymyxin、octapeptins 和 bactracin[57].

　　多肽类化合物是芽孢杆菌产生的一种线状、环状和分枝状的化合物。Tyrocidine、edeine 和 gramicidin 是短短芽孢杆菌 B. brevis 产生的线状抗真菌短肽[58].蜡质芽孢杆菌产生的 azoxybacillin 是一种广谱抗真菌物质，由一个脂肪氨基酸和甲基偶氮氧侧链组成，抑制真菌对硫的吸收[59].

　　2.2.2 抗菌蛋白 某些生防芽孢杆菌能够产生蛋白类抗菌物质并将其分泌到胞外，主要包括细菌素、降解细胞壁的酶类以及一些未知的抗菌蛋白。细菌素是由细菌合成的，对其他微生物有拮抗作用的小分子量蛋白，多种芽孢杆菌都能产生细菌素[60].芽孢杆菌产生的 subtilin 是研究比较深入的细菌素，对革兰氏阳性细菌有很强的活性。降解细胞壁的酶类主要包括几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、TasA（transition-phasespore-associated antibacterial protein,TasA）等。病原真菌的细胞壁组分中含有几丁质和 β-1,3-葡聚糖。几丁质酶是一种分解聚 N-乙酰氨基葡萄糖分子的糖苷酶，通过降解真菌细胞壁来达到防病的效果。β-1,3-葡聚糖酶是植物病程相关蛋白，β-1,3-葡聚糖酶与几丁质酶协同作用抑制真菌生长，同时可以从寄主或病原物细胞壁释放出葡萄糖片段作为信号分子，激发寄主植株的防卫反应。多种芽孢杆菌能同时产生一种或多种几丁质酶或同时产生 β-1,3-葡聚糖酶[61].TasA 对革兰氏阳性和阴性细菌均具有广谱抗菌活性[62].TasA的产生伴随着芽孢的形成，在芽孢内产生，大约 30 min 后，向芽孢外分泌[63].唐丽娟等[64]研究发现地衣芽孢杆菌 W10 的上清液对灰葡萄孢没有抑菌活性，硫酸铵盐析后表现出抑菌活性，表明其抑菌物质是蛋白。Liu 等[65]从枯草芽孢杆菌 B-916 中分离到一种新蛋白 bacisubin,分子量为 41.9 kDa.抗菌蛋白的抗病机制包括抑制病原菌孢子的产生和萌发，使菌丝畸形，细胞壁溶解，原生质泄露等。

　　2.3 溶菌作用
　　
　　溶菌作用，是指生防微生物通过吸附在病原真菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，而后产生溶菌物质消解菌丝体，使菌丝发生断裂、解体、细胞质消解等；或者产生次生代谢产物对病原菌孢子的细胞壁产生溶解作用，导致细胞壁穿孔、畸形等现象。林福呈等[66]发现枯草芽孢杆菌 S9 与立枯丝核菌在 PDA 平板对峙培养过程中不形成抑菌圈，通过扫描电镜观察发现菌株 S9 吸附在立枯丝核菌的菌丝上，产生溶菌物质，将病原菌菌丝溶解。Liu 等[65]从枯草芽孢杆菌 B-916 中分离到 1 种新蛋白 bacisubin,在与立枯丝核菌对峙培养过程中可使菌丝顶端肿大、破裂。枯草芽孢杆菌分泌的细胞降解酶，主要有几丁质酶、蛋白酶、纤维素降解酶系、半纤维素降解酶系等，能对多种病原菌，如纹枯病菌、立枯丝核菌、镰刀菌和卵菌等，都产生较强的溶菌作用[67].然而，由于酶具有底物特异性和病原菌的细胞壁成分不一样，不同的芽孢杆菌对不同的病原菌的溶菌作用不一样。如卵菌的细胞壁主要由纤维素组成，因此理论上针对卵菌病原菌要筛选高效分泌纤维素酶系的芽孢杆菌防治效果更好。目前关于芽孢杆菌溶菌作用的研究报道不多，其作用机制及方式有待更多的试验证明。

　　2.4 诱导植物抗病性

　　研究表明，生防芽孢杆菌能激发植物的诱导抗病性（ISR）信号通路，提高植株抗病能力。生防菌引起的诱导抗性与病原物引起的植物系统获得抗性（SAR）在信号通路上并不相同[68,69].生防芽孢杆菌能激发植物的诱导抗病性（ISR）主要依赖于 JA 和 ETH 信号通路，而病原物引起的植物系统获得抗性（SAR）主要依赖于 SA 信号通路。ISR 和 SAR 在表型特征上具有相同性，主要包括诱导木质素形成和伸展蛋白（HRGP）的积累、诱导病程相关蛋白（PR 蛋白）的产生、酚类物质积累和诱导寄主植株防御酶活力等。

　　一般认为 SAR 由病原细菌引起[70].van der Ent 等[71]研究表明某些根围促生菌（PGPR）可以诱导植株产生系统抗病性；Niu 等[72]研究发现，通过喷施蜡质芽孢杆菌 AR156 后诱导拟南芥植株体内防卫反应相关基因表达，提高植株抵御病原菌入侵；枯草芽孢杆菌 S499 产生的 surfactin 和 fengycins 两者协同作用激活植株产生 ISR[73];有报道认为，不同结构的 surfactin 类物质其诱导产生的 ISR 活性也不相同[74,75].有研究发现芽孢杆菌能产生挥发性气体化合物 3-羟基-2-丁酮（3-hydroxy-2-butanone）和 2,3-丁二醇（2,3-butanediol），这类化合物不仅能促进植物生长，还具有明显的诱导植物产生诱导系统抗性的作用[75].

　　芽孢杆菌分泌的脂肽类抗生素等都可以作为诱导因子[76-79],作用于植物细胞的受体蛋白，激活植物细胞内抗性的初步反应，然后通过茉莉酸途径、乙烯途径和水杨酸途径作用于正调控蛋白诱导植物体内抗病性相关基因的表达，如抗菌酶的合成、细胞壁的增厚、激活植物抗毒素和脂氧合酶途径等，增强植物对病原菌入侵的防御能力。

　　3 存在问题与应对措施

　　生防芽孢杆菌能够有效地预防和控制农作物病害发生和发展，并且能够直接或间接促进植物生长，因此被普遍认为是一种对环境友好、经济有效的防治病害和提高作物产量的途径。目前利用芽孢杆菌防治植物病害已取得巨大成绩，国内外已经开发多种生防芽孢杆菌制剂，并广泛应用于生产。但是，在生产应用实践中也出现了一些问题，影响其生防效果，需寻找相应的对策。

　　3.1 生防芽孢杆菌在实践应用中存在的问题

　　实践证明，芽孢杆菌生防菌株在田间的定殖能力是其生物防治效果的关键。目前实验室条件下，能够筛选出大量对植物病原菌具有很强拮抗活性的芽孢杆菌菌株，但这些拮抗菌株作为生物防治因子应用于防治植物病虫害时，能否在田间稳定地定殖，或者在田间施用农药或残留农药的情况下，仍然可以保持一定的种群数量，成功定殖在植物叶、根围并形成优势种群，是活体类生物农药大规模开发并商品化应用于农业生产的关键因子之一[80,81].目前对生物活菌体生物农药定殖机理深入细致的研究报道比较少。

　　芽孢杆菌所产生的抗菌物质比较复杂，由于这些此生代谢产物容易受田间环境（如光照、温度、pH、雨水）和植物微生态中多种因素（如病原菌、中性微生物、植物自身分泌的毒素或其他产物）的影响发生降解、分解，从而无法发挥生防作用。因此，维护芽孢杆菌所产生的抗菌物质的稳定性对于确保生防菌株的生防效果是非常重要的。

　　目前芽孢杆菌生防菌制剂多为活菌制剂，在生产上推广应用时，能否在植物病害发生的关键时期，喷施足量的活菌制剂，这直接影响生防效果[81];另外，活菌制剂田间应用时常受到温度、湿度、土壤、pH值等外界因素的影响[82],因此防治效果不是很稳定。

　　3.2 问题与对策

　　3.2.1 生防菌株混配或复配 生防菌株混配或复配是提高定殖水平和防治效果的一种对策。如枯草芽孢杆菌 GBO3 和短小芽孢杆菌 INR7 混配后处理黄瓜种子，可以显着提高对多种病害防治效果[83].陈志谊等[84]研究了不同拮抗细菌之间的互作关系及其对生防效果的影响，筛选适当的生防菌株进行组合复配，能够有效的提高防治病害的效果。

　　3.2.2 生防菌与化学农药或化学物质混配 陈志谊等[85]将枯草芽孢杆菌与井冈霉素复配，用于防治水稻纹枯病和稻曲病，防效良好且稳定，深受农民欢迎。Liu 等[86]利用枯草芽孢杆菌和 NaHCO3混配在防治采后梨轮纹病上效果显着。生防菌与化学农药混配使用是提高生防菌株防效的有效措施，但是，在实际应用中要考虑生防菌株与化学农药的相容性、最佳配比等。

　　3.2.3 芽孢杆菌类生物杀菌剂田间高效使用技术 生防菌剂为活菌制剂，田间使用技术与化学农药的使用技术有较大的区别。如：芽孢杆菌生防菌剂一般要求在发病初期进行防治，过早或过迟对生防效果影响较大，生防菌剂的使用浓度也是生防效果的关键因素之一[87,88],要保证有足够的生防菌种群数量，在植物根、叶围顺利定殖，建立优势种群，并且要根据生防菌在植物微生态环境的定殖情况，确定田间使用剂量和防治间隔期，以确保生防效果[89].

　　3.2.4 芽孢杆菌类生物杀菌剂剂型加工工艺 目前我国芽孢杆菌类生物杀菌剂的剂型只有水剂、可湿性粉剂和悬浮剂，远远不能满足生产上的需求。活菌类生物杀菌剂的剂型加工比较困难[90].在筛选各种助剂（如表面活性剂、分散剂、润湿剂、崩解剂）和填料时，不仅要考虑各种助剂的理化性能是否符合制剂要求，还要保证它们与生防菌有高度的相容性[91,92].通过剂型的研究，不仅可以解决活菌类生物农药的保质期问题，还能够提高生防菌在植物根、叶围的定殖数量，有效地提高生物防治效果。

　　3.2.5 基因工程改良生防菌株 生防芽孢杆菌的遗传改良是当前研究微生物防治植物病害的热点[93].主要是通过对芽孢杆菌的遗传改良增强其抗菌活性、扩大其抑菌谱、增强其在植物寄主上的定殖能力，从而提高防病能力。包括提高抗菌物质的表达、增强竞争能力、增强诱导抗性等几个方面进行改良。王益民[94]将环状芽孢杆菌 B. circulans β-1,3?葡聚糖酶基因和 Serratia marcescens 几丁质酶基因分别导入生防芽孢杆菌 B908 中，进一步提高了对立枯丝核菌菌丝的裂解作用。高学文等[95]构建枯草芽孢杆菌基因工程菌，脂肽类抗生素活性物质分泌量显着提高。

　　4 展望
　　
　　随着科学的发展，人们对食品、环境安全要求的日益严格，迫切需要发展符合现代社会发展的生物农药。生防芽孢杆菌不仅能够有效控制植物病害的为害，同时具有无毒、无残留、无致病性、对人畜安全、环境相容性好、植物病原菌不易产生抗性、促进植物生长等优点，满足了消费者对农产品产量、质量和安全性的多重要求。因此，各国学者和植保专家均采取扶持措施，积极推进生物芽孢杆菌的研究和应用。尽管当前化学杀菌剂在农药产业中仍占主导地位，但生防芽孢杆菌类杀菌剂研发与应用，符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治（IPM）的需求，对农业的可持续发展具有重要的意义，同时生物发酵生产成本低廉、适合产业化生产[96],有较强的市场竞争能力和良好经济效益，必将会有广阔的应用前景，并产生巨大的经济、社会和生态效益。