流感病毒RNA聚合酶的结构与功能及其应用

　　每次流感大流行都对国际社会稳定和经济发展带来严重影响，因此很有必要研发流感防治药物。

　　目前有两类(神经氨酸酶抑制剂和 M2 蛋白阻滞剂)应用于流感病毒的药物，但是随着其耐药性逐渐出现，开发有效的靶向不同的病毒蛋白抗流感药物是迫切需要的。流感病毒 RNA 聚合酶高度保守，在流感病毒基因组 RNA 复制，病毒 mRNA 转录以及维持病毒生命周期中发挥着重要作用，因此成为目前药物筛选与研究的首选靶点。

　　1 流感病毒 RNA 聚合酶的结构
　　
　　流感病毒 RNA 聚合酶是一个由 PB2，PB1 和PA 三个亚基组成的异源多聚体，通过与病毒 RNA及核衣壳蛋白组装形成 vRNP 复合体来介导病毒基因组的转录与复制(关于 vRNP 本综述不做详细介绍)。该多聚体非常稳定，可以通过亲和层析纯化可获得完整的 RNA 聚合酶复合体，该复合体又被称为 3P 蛋白质，相对分子质量大约 250 000 g·mL－ 1。这 3 种蛋白质是病毒粒子中分子量最大的蛋白质，分别为 PBl (质量为 96 000 g·mL－ 1)，PB2 ( 质量为87 000 g·mL－ 1)，PA(质量为85 000 g·mL－ 1)。其中分子量较大的两种蛋白质呈偏碱性，称为碱性蛋白 1(basic protein 1，PB1)和碱性蛋白 2(basic pro-tein 2，PB2);分子量最小的蛋白质显酸性，称为酸性蛋白质(acidic protein，PA)。该蛋白复合物在病毒粒子中位于病毒基因 3' 端，用免疫电镜技术直接观察到该复合体位于每一个核壳体的一端。
　　
　　对于 RNA 聚合酶各亚基的装配及其相互作用也有较多的研究和报道。通过三维重构技术得到的聚合酶复合体的结构相当紧凑，各亚基之间无明显界限。通过生化、遗传及结构学研究表明，PB1 亚基位于 3P 蛋白的核心，PB1 亚基的 N 末端与 PA 亚基的 C 末端相连，PB1 亚基的 C 末端与 PB2 亚基的N 末端相连，形成稳定的蛋白质复合物。关于这几个亚基相互作用位点存在很大的争议，有研究报道，PB1 通过其 N 末端(残基 1 ～ 25) (A/goose/Guangdong /1 /96 (H5N1))、C 末端(残基 678 ～ 757)(A/Puerto Rico/8/1934)，分别与PA 亚基C 末端(残基 668 ～ 692)(A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1))、PB2 亚基 N 末端 ( 残基 1 ～ 37) ( A / Puerto Rico /8 /1934)相互连接。此外，有研究表明，这 3 个亚基都包含一个功能性的核定位信号(NLS)，其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能分别独立的进入细胞核，之后在细胞核内组装成完整的聚合酶复合物。也有研究表明，PB1 和 PA 首先装配成异源二聚体，在 RanBP5 或 Hsp90 蛋白的帮助下运输到细胞核内，然后再与核内的 PB2 装配成完整的聚合酶复 合 物。近 年 来，利 用 双 分 子 荧 光 互 补(BiFC)方法研究流感病毒聚合酶复合物(H1N1A / WSN /33)组装中蛋白质-蛋白质相互作用的试验中，检测到 PA 及 PB2 之间的也有相互作用，PA 蛋白 N 端 100 个氨基酸残基负责 PA-PB2 之间的互动。

　　2 流感病毒 RNA 聚合酶的功能

　　流感病毒 RNA 聚合酶复合体是一个多功能酶，不仅具有 RNA 聚合酶活性，同时也具有核酸酶活性。

　　流感病毒的病毒 RNA(vRNA)转录形成 mRNA过程的启动需要有加帽的引物(capped RNA prim-er)，该引物是从宿主细胞的 mRNA 上剪切下来的，该功能就是由病毒的 RNA 聚合酶完成的。具体如下，在病毒基因组的转录过程中 RNA 聚合酶以病毒 RNA(vRNA)为模板，通过聚合酶特异性的结合位点与宿主细胞 mRNA 的帽子结构相结合，从而发挥核酸内切酶活性，从宿主细胞 mRNA 嘌呤碱基处剪切下一个含有(10 ～ 13)个碱基的 RNA 片段，作为引物起始转录 vRNA，合成 mRNA。当病毒聚合酶在模板5' 端遇到富集 U 区时，发生“stutter”产生 Po-ly(A)尾结构并终止转录，至此完成了转录过程进入复制模式。因而，完整的 mRNA 其 5' 端具有 1 型帽子 Cap-1 结构，3 端带有 Poly(A)尾巴。在转录过程中，病毒 RNA 聚合酶还具有 3'-5' 的核酸外切酶活性，利用该酶活性可以将新合成的 3' 端错配的碱基切除，保证转录的真实性，起到校对转录本的作用。

　　除了上述转录过程，流感病毒 RNA 聚合酶还负责流感病毒的复制。与转录过程相比，复制过程简单很多，既不需要帽子结构作为引物也不需要多聚腺苷酸化。首先，RNA 聚合酶以 vRNA 作为模板合成其互补链 cRNA，接下来再以 cRNA 链作为模板合成 vRNA。总之，在病毒感染的早期阶段 RNA 聚合酶处于转录的模式，在感染的晚期阶段 RNA 聚合酶处于复制的模式。

　　3 流感病毒聚合酶各亚基的结构和功能
　　
　　3． 1 PB2 PB2 是个多功能的蛋白。其在病毒mRNA 转录的起始阶段能识别并结合 5' 端 I 型帽子结构，启动转录过程。然而对结合位点的位置却有很多争议。最早通过交联实验表明，PB2(A/PR8)上有两个独立的基序参与 RNA CAP-1 结合，一个位于 N-末端氨基酸残基 242 ～ 282 位，另外一个位于C-末端氨基酸残基 538 ～ 577 位。接着通过基因突变研究表明，PB2 亚基(A/WSN/33，B/Aichi/5/88，C / JJ /50)的 2 个芳香族残基-Phe363，Phe404 是帽结合的关键位点，它们与帽子上带正电的 N(7)-甲基鸟嘌呤形成三明治样结构。而且这 2 个芳香族氨基酸在 A，B 和 C 型流感病毒中高度保守。最近 Guilligay 等对 PB2 亚基(A/Victoria/3/1975(H3N2))的中心区域进行原子分辨率的结构测定以及功能分析，发现帽子结构的结合位点位于318 ～ 483 位氨基酸残基区域。帽结合结构域是一个紧凑、有序的 α-β 褶皱。它是由 5 个不平行的 β折叠(β1，β2，β5，β6 和 β7)、4 个 α 螺旋(α1 ～ α4)及两侧的 C-末端部分组成的短 β 折叠(β8 ～ β12)构成(见图 1)。对其结合区域碱基突变会影响病毒转录但却不影响病毒的复制。因此，该区域可以作为抗流感病毒药物的靶点，设计帽子结构的类似物，与该领域相互作用，抑制 RNA 聚合酶的活性进而抑制流感病毒的复制。也有研究表明，PB2 亚基与帽子结构结合区域中起关键作用的活性位点主要是arg355，his357，Glu361 以及 Gln406 等残基。它们在帽识别和形成芳香族三明治过程中提供最重要的氢键和疏水作用。
　　
　　有研究组使用共沉淀结晶的方法获得了 PB2N-PB1C(A / Puerto Rico /8 /1934) 的晶体结构，确认了PB2 亚基通过其 N 末端(1 ～ 37)氨基酸和 PB1 亚基C 末端 86 个氨基酸相互连接。尽管该晶体结构的体积较小，但是对于三聚体之间的互动却是必须的，同时由于它们相互作用的界面在跨种属的禽流感和人流感毒株中却是完全保守的，因此该相互作用位点也可能是一个药物作用位点。

　　关于 PB2 亚基部分信息是在研究其在细胞质与细胞核之间运输过程中获得的。研究表明，PB2亚基 C 末端(678 ～ 757)(A/PR8)氨基酸残基区域存在二重核定位信号(NLS;737RKRX12KRIR755)，保证了 RNA 聚合酶通过核孔复合体被运到细胞核内。Tarendeau 等没有获得 NLS 域独立结晶(A / Victoria /3 /75(H3N2))，但却获得了其与输入蛋白α5(importin-α5)共结晶的 X 射线结构图。该研究详细说明了 NLS 二重定位特性及其与输入蛋白-α绑定时 NLS 区域的构象变化。

　　PB2 亚基与流感病毒宿主嗜性有关。用统计学方法对美国国家生物技术信息中心(NCBI)及全球倡议所有流感数据共享数据库(GISAID)获得的野生型病毒分离株进行序列比较、分析后发现与宿主嗜性相关的基因主要集中在流感病毒聚合酶亚基上。其中有 2 个在 PA 亚基上，3 个在 PB1 亚基上，13 个在 PB2 亚基上。这与流感病毒宿主嗜性与PB2 亚 基 上 多 个 基 因 相 关 的 研 究 结 果 相 一致。许多研究表明，PB2 的 627 位可能是 A型流感病毒宿主范围的重要决定位点之一，对当时所搜集到的数据进行分析后显示，所有人源流感病毒 PB2 的 627 位均为 K，禽源流感病毒则均为 E，因此推测 PB2 的 627 位与宿主嗜性相关。接着有许多关于突变原因的研究，其中一个主要的假设是 e627k 突变能使病毒在较低温度下复制，从而导致病毒能在哺乳动物细胞中复制，这一假设与在哺乳动物上呼吸道温度(33 ～ 35 ℃)明显低于禽肠道温度(37 ～40 ℃)现象相一致。

　　PB2 蛋白序列不同于其他蛋白序列，因此不能使用序列比对法识别其结构域。同时，全长 PB2 不能可溶性表达，导致针对该亚基的研究进展缓慢，直到 ESPRIT(基于随机文库构建的筛选过程，可以随机筛选到 90 000 个 PB2 片段)技术的产生，才得到一系列用于结构研究的大肠杆菌表达的可溶性 PB2片段。接着有研究组运用 ESPRIT 方法获得一个PB2 大的 C-末端可溶性片段，该片段包括 627 域(因含有与宿主嗜性相关的 627 位氨基酸被命名为627 域)和 NLS 域。这两个域通过一个极性界面紧紧靠在一起，侧链暴露着赖氨酸和谷氨酸两个可溶性氨基酸。接着有研究表明，627 位突变会破坏627 域的表面贴片。同时，贴片学说解释了 2009 年流感大流行 H1N1 病毒 627 位点是 E，确可以在人类广泛传播，可能由于双突变(g590s 和 q591r)补偿导致，其中 arg-591 有效屏蔽了 glu-627 的负电荷，重新建立了基础表面贴片，因此导致病毒可以在人类的传播。

　　PB2 亚基第 701，714 位氨基酸也被认为与流感病毒在哺乳动物体内繁殖相关。其机制可能与这两个氨基酸参与 PB2 与宿主蛋白之间的相互作用有关。同时该研究表明，这两个氨基酸处于PB2C 端结构域的双向核定位序列(NLS) 中，通过核磁共振 (NMR Nuclear MagneticResonance) 图显示PB2 第 627，701 及 714 这 3 个氨基酸位点均位于蛋白质三维结构的外表面。

　　此外，PB2C 末端可以与宿主细胞输入蛋白 α-1，5，7 相互作用，从而将 PB2 亚基输入细胞核。二者之间的相互作用在病毒 RNA 聚合酶的组装以及病毒对宿主细胞适应方面发挥着重要作用。还有研究表明，PB2 亚基不仅存在于细胞核内，在线粒体内也有分布，它能够与线粒体抗病毒信号蛋白相互作用，抑制线粒体介导的β干扰素的表达，在决定病毒毒力方面发挥着重要作用。

　　3． 2 PB1 PB1 亚基是 RNA 聚合酶的核心亚基，其中 PA 羧基末端结构域形成一个新的折叠即形成深的，高度疏水凹槽，而 PB1 氨基末端残基则形成一个适合的 3(10)螺旋插入其中。这一复合体结构从外观看类似于一个龙头(PA 羧基端)嘴部咬着一块骨头(PB1 短肽)。PB1N端 7 ～ 10 个氨基酸残基构成的短 LLFI 基序在与 PA 相互连接中起重要作用。有研究表明，PA 与 PB1 的连接对聚合酶复合体的活性及病毒繁殖能力起关键作用。而 PB1亚基的 C 末端与 PB2 亚基的 N 末端连接区域存在一个由 3 股螺旋形成的涡轮状的结构，该结构对聚合酶的活性起着十分重要的作用，相应的碱基突变会导致酶的转录复制活性大幅降低。因此该连接区可以作为抗流感病毒药物的重要靶点。

　　PB1 亚基是 RNA 聚合酶的催化中心，既参与mRNA 转录又参与 vRNA 的复制。同时，PB1 与vRNA 和 cRNA 的不同结合特性提示，RNA 聚合酶在病毒基因组的复制和转录过程中可能存在构象变换。有研究表明，其构象变化可能是由于 vRNA 5'端与 PB1 第571 ～572 两个 Arg 残基结合时导致的。

　　构象转换是帽子结构与内切酶活性位点激活的原因之一。

　　此外，PB1 亚基上有 4 个高度保守基序(A，B，C，D)，该基序存在于所有 RNA 病毒 PB1 亚基上。

　　其中 C 序列区参与了 vRNA 链的延长。有研究表明，该保守序列上的基因变异，会导致聚合酶的活性明显下降。因此，这些高保守基序在流感病毒转录及复制过程中起着重要的作用。PB1C端(731 ～757 氨基酸) ( A / goose / Guangdong /1 /96 ( H5N1 ))可以通过干扰流感病毒聚合酶的组装抑制病毒的复制繁殖。更有趣的是，该段氨基酸是通过与 PB1C端相互作用干预 PB1C端与 PB2N端的连接。该研究为抗流感新药的研发奠定了基础。

　　3． 3 PA 亚基 PA 亚基是聚合酶中的一个关键蛋白。它能够被胰蛋白酶切割为两个部分:25 kD 的PAN端和 55 kD 的 PAC端。这两个区域是分开的，由一个 20 个氨基酸的长链肽连接，该连接肽能提高 PA 构象的灵活度。同时该连接肽的缺失能导致 PA 亚基的 N 端与 C 端都不能与 PB1 相互作用。针 对 PAN端 及 PAC端 ( A/goose/Guang-dong /1 /96(H5N1))晶体结构及功能的研究较多。

　　研究表明，其 PAN端是由α/β 组装而成，由 7 个 α螺旋包绕着 5 个 β 折叠组成，其 α2-α5 螺旋及 β3折叠组成的带负电的空腔是金属离子的结合位点(图 2)。PAC 端由 13 个 α 螺旋，一个短 310螺旋，9个β折叠和几个环及转角组成。PAC端整体结构从外观看类似于一个龙头，由两部分组成，一部分似“龙脑”，一部分似“龙嘴”。龙脑由 5 个 α 螺旋，一个短 3(10)螺旋包绕着 7 个 β 折叠构成，龙嘴由 8 个α螺旋，2 个 β 折叠则构成(图 3)。通过结构比对显示，PAC与其他蛋白质结构无相似性，表明 PAC有新的折叠。最新研究表明，PAN含有核酸内切酶的活性位点，该活性可以通过金属离子激活。Yuan 等(A / goose / Guangdong /1 /96(H5N1))，在 Mg2 +存在下，得到了 PA 亚基 N 末端的晶体结构，发现1 ～197位氨基酸残基区域存在核酸内切酶的活性位点。

　　Mg2 +与电负性空穴的保守酸性氨基酸残基相结合，相应的氨基酸残基发生突变会导致核酸内切酶活性下降，然而复制酶的活性保持不变。Dias 等(A /Victoria /3 /1975(H3N2))，在 Mn2 +离子存在下，也获得了 PA 亚基 N 末端的晶体结构，发现核酸内切酶活性位点存在于 1 ～ 209 位氨基酸残基区，两个Mn2 +与相应的酸性氨基酸残基相互结合，表明核酸内切酶是一个双离子介导的作用机制。双离子Mn2 +能介导最佳的核酸内切酶活性，而 Mg2 +介导的活性只能达到双离子介导的 50%。然而考虑到在生理条件下的浓度远远高于 Mn2 +，因此 Mg2 +可能协同介导细胞内核酸内切酶的活化。此外，该活性可以被已知的流感病毒核酸内切酶抑制剂(2，4-dioxo-4-phenylbutanoic acid)抑制。对其结构进行研究表明，PAN可能是(P)DXN(D/E)XK 核酸内切酶家族的一名新成员。

　　PAC端参与 PA 与 PB1 之间的相互作用。PAC端龙嘴区域的 4 个 α 螺旋提供了一个高度疏水的口袋，该疏水口袋上的一些氨基酸残基，特别是一些疏水氨基酸，诸如 F441，M595，L666，W706，F710，V636，L640 通过疏水、氢键、范德华力作用与 PB1亚基 N 末端的 1 ～15 个氨基酸残基相互连接，形成稳定的复合物。Kawaguchi 等发现，PAC通过493 ～ 512 位及 557 ～ 574 位氨基酸( A / PR /8 /34) 这两个区域与宿主蛋白 hCLE 和微型染色体维持复合物(MCM)相互作用。Liang 等研究发现，PAC末端区域还具有蛋白核定位，参与病毒 RNA 的合成以及反式作用因子等功能。

　　PA 具有诱导蛋白水解的活性，可诱导病毒和宿主蛋白的水解。因此可以降低自身蛋白和与其共表达的异源蛋白质的累积水平。它是一种磷酸化蛋白，Ser 和 Thr 是其磷酸化位点。有研究表明，此蛋白水解活性与 3P 聚合体复制功能有关。该报道中称，PA 基因 157 位 Thr-Glu 突变导致其完全丧失蛋白水解功能。以该突变基因重构的 RNA 聚合酶丧失了由 vRNA 合成 cRNA 的能力，但转录 vRNA功能不受到影响。PA162 位 Thr-Ala 的突变导致其诱导蛋白水解的能力降低，但没有完全丧失，其RNA 聚合酶的聚合活性也表现出中等水平。这表明 RNA 聚合酶活性与 PA 介导的蛋白水解活性存在正相关性。进一步研究表明含有 PA162 突变体亚基的病毒表现出野生型的表型，而含有 PA157突变体亚基的病毒无论在低感染剂量还是在高感染剂量下病毒的繁殖能力均降低。该突变体病毒在小鼠体内也呈现出减毒的特征。

　　此外研究表明，PA 亚基还具有以下功能:在vRNA 的合成中，PA 可以与 cRNA 启动子结合;PA 参与 RNA 聚合酶与 RNA 的相互作用;PA 可能与毒力有关;PA 亚基还具有糜蛋白型丝氨酸蛋白酶活性，624 位的 Ser 残基是其活性的关键位点，但这种蛋白酶的具体功能还不清楚;PA 参与了 3P 聚合体从没有活性的中间体装配成有活性复合物的过程;PA 亚基还能影响 RNA 聚合酶的多种功能，包括 3P 多聚体的稳定性、活性、帽结合能力，与 vRNA 启动子结合能力。

　　4 流感病毒聚合酶抑制剂

　　流感病毒 RNA 聚合酶高度保守，介导着病毒基因组的转录与复制，因此成为目前药物筛选与研究的首选靶点。针对流感病毒 RNA 聚合酶的药物可以分为聚合酶抑制剂、核酸内切酶活性抑制剂。

　　4． 1 流感病毒聚合酶抑制剂分类 其中聚合酶抑制剂可分为核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂。1987 年 Pravdina 等研究发现，3'-amino-3'-deoxy-和 3'-azido-3'-deoxyribonucleo-side-5'-triphosphates 核苷类抑制物可以抑制流感病毒转录，其抑制效果比当时众所周知甲型流感病毒复制抑制剂 ribavirine 5'-triphosphate 更有效。Well-come 实验室对核苷类逆转录酶抑制剂 2'-flu-orodGuo 进行了研究。研究表明，该抑制剂可被细胞酶磷酸化，可以可逆地抑制流感病毒感染鸡胚 4 h内的复制。RNA 杂交的研究结果表明，10 μmol·L－ 1化合物即可终止流感病毒 RNA 转录，但即使高浓度化合物(200 μmol·L－ 1)也没有抑制细胞自身蛋白质的合成。体外实验表明，该化合物是竞争性抑制流感病毒的逆转录酶活性从而中断的病毒的转录，其Ki(药物分子对蛋白酶抑制作用的抑制常数) 值为1 μm。Favipiravir(T-705)也是核苷类转录酶抑制剂，它是一类广谱抗流感病毒药，能有效的抵抗H1N1，H5N1 以及最近出现的 H7N9 禽流感病毒。

　　能降低流感病毒的耐药性，与奥司他韦联合使用对抵抗流感病毒有协同作用。目前已在日本完成Ⅲ期临床试验。T-705 作用机制主要是抑制流感病毒RNA 聚合酶的活性。T-705 在细胞内被细胞酶转换成活性代谢产物 T-705-4-ribofuranosyl-5'-triphosphate(T-705RTP)，然后 T-705RTP 作为一个核苷类似物竞争性抑制 GTP 和 ATP 的合成。该化合物 IC50值为 1． 0 μmol·L－ 1，CC50值高达 6 370μmol·L－ 1。此外，针对非核苷类逆转录酶抑制剂 4-［(4-butylphenyl) amino］-2-methylene-4-oxo-butanoic acid(d282)体外实验表明，该药物可以通过抑制嘧啶合成抵制甲型和乙型流感病毒。但体内实验表明，该药物不能防止感染流感病毒小鼠的死亡。

　　4． 2 抑制 RNA 聚合酶核酸内切酶 抑制 RNA 聚合酶核酸内切酶的活性也是流感病毒感染治疗药物研发的一个新方向。随着对 PA 晶体结构深入研究，研究人员渐渐认识到多价金属离子在核酸内切反应的酶催化过程中发挥着重要作用，因此可以通过一些金属螯合剂与 PA 亚基金属域相互作用特异性地抑制核酸内切酶活性。1994 年 Merck 公司研究团队发现了 4-substituted 2，4-dioxobutanoic acid系列化合物是核酸外切酶抑制剂，其 IC50值 0. 2 ～29. 0 μmol·L－ 1。flutimide 是从一个新的 del-itschia cofertaspora 物种分离得到，可以选择性地抑制A，B 型流感病毒复制，IC50值为 5． 5 μmol·L－ 1。

　　2-氧基丁酸类 L-735882 及其衍生物，可以高度选择性抑制 A，B 型流感病毒的复制。沙利度胺衍生物 PPT-65，PPT-66，PPT-67 也可以抑制 PA 核酸外切酶的活性。BPR3P0128 通过抑制核酸内切酶活性抑制了 A 型和 B 型流感病毒的复制。其 IC50值在 51 ～190 nmol·L－ 1。Bauman 等使用晶体片段扫描的方法获得一系列高度有效的羟基吡啶酮化合物，其中活性最高化合物 IC50值为 11 nmol·L－ 1。

　　L-742，001 是二酮酸类化合物，有研究表明 PA 上活性中心或其周围疏水口袋上碱基突变会导致流感病毒耐药株出现。

　　4． 3 小分子抑制剂 此外，Muratore 等使用现有的聚合酶蛋白之间相互作用晶体结构，确定一些潜在的小分子抑制剂。其中一个小分子抑制剂可以通过抑制 PB1-PA 复合物的核输入进而抑制 RNA聚合酶的转录作用。该小分子抑制剂可以抑制H3N2、季节性 H1N1 及 2009 大流行株 H1N1。更重要是，它同时可以抑制奥司他韦耐药株。

　　综上所述，流感病毒 RNA 聚合酶是一个多功能酶，既是转录酶又是复制酶。同时，该酶较为稳定，具有高度保守性及低突变率，不像表面抗原血凝素HA 和 NA 那样容易发生变异。因此，对流感病毒RNA 聚合酶的结构和功能进行深入研究，找出其关键结构域和酶活性位点及其他功能位点，有望开发用于防治流感的高效、低毒、副作用小的破坏酶结构或抑制酶活性的新型药。