口蹄疫病毒L蛋白酶编码基因SAP区域的定点突变

　　口蹄疫是由口蹄疫病毒 (foot-and-mouth di-sease virus,FMDV)引起偶蹄动物的一种急性、热性、接触性传染病。FMDV具有O、A、C、SATⅠ、SATⅡ、SAT Ⅲ及Asia 1共7个血清型,各血清型之间没有交叉保护,每个血清型又分为很多亚型。

　　FMDV基因组编码4种结构蛋白和9种非结构蛋白,其中L蛋白酶是FMDV的一个毒力决定因素。

　　FMDV已经进化出了一些机制以逃避宿主的免疫应答,其中L蛋白酶在致病性上发挥着关键作用。L蛋白酶是一个木瓜样蛋白酶,可以将自己与聚蛋白分离。L蛋白酶可以通过半胱氨酸蛋白酶活性切割转录起始因子eIF4G,关闭宿主的翻译,最终导致干扰素表达水平下降。FMDV缺失L蛋白酶编码区后,其致病力明显减弱。

　　L蛋白酶编码区第47~83位氨基酸处存在保守蛋白域,该区域被称为SAF-A/B、Acinus以及PIAS(SAP)区域,SAP区域通常与调解活化剂和抑制剂之间相互作用的转录控制相关。

　　防控FMD的主要技术手段是疫苗免疫。口蹄疫病毒受自然属性的限制,导致部分疫苗毒株生产性能不高,免疫效力低下。为解决疫苗生产过程中疫苗效价较低、抗原匹配性较差的问题,研究人员利用 反 向 遗传技术获得了嵌 合 毒 株rA-WT-FM-DV。该嵌合毒株解决了这一难题,提高了疫苗效价和产量,可以使疫苗毒株和流行毒株很好地匹配,提高了免疫效力。但是,该毒株的种毒为强毒,存在生物安全隐患。为此,本研究对嵌合毒株rA-WT-FMDV的L蛋白酶编码基因的SAP区域进行了定点突变,以期提高嵌合毒株的生物安全性,进而为进一步研制生物安全性高的疫苗毒株提供生物材料。

　　1 材料与方法

　　1.1 质粒和细胞系

　　重组质粒prA-FMDV(含A/WH/CHA/09结构蛋白的感染性克隆,拯救病毒被命名为rA)由中国农业科学院兰州兽医研究所病毒基因工程课题组构建保存。

　　BHK21细胞由本实验室保存。

　　1.2 主要试剂与载体

　　限制性内切酶AflⅡ、PacⅠ,PrimeSTAR HSDNA聚合酶、T4DNA连接酶、JM109感受 态细胞、DNA Marker等均购于宝生物工程(大连)有限公司。

　　Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System购 于Promega公 司。

　　AxyPrep PlasmidminiprepKit为AxyGEN公 司 产 品。

　　Lipofectamine 2000、Opti-MEM均为Invitrogen公司产品。

　　MEM细胞培养基与胎牛血清均购自HyClone公司。

　　RNeasyMini Kit购自QIAGEN公司。表达质粒pcDNA3.1(+)由本实验室保存。

　　1.3 引物的设计
　　
　　根据prA-FMDV全长cDNA序列,设计分别含PacⅠ和AflⅡ酶切位点的引物以扩增表达质粒pcDNA3.1(+)。引 物pCD-AflⅡ-F的 序 列:5′-TTTTCCTTAAGGGGCCCGTTTAAACCCGCT-GAT-3′,下 划 线 处 为PacⅠ的 酶 切 位 点 ;引 物pCD-PacⅠ-R的序列:5′-CTTAC TTAATTAA-GCTAGCCAGCTTGGGTCTCCCTA-3′,下划线处为AflⅡ的酶切位点。同时设计在L基因SAP域引入突变的磷酸化引物F-P和SAP-P。

　　F-P:5′-GAC-CTCACAGGGCTTGAACTGCACGA-3′,SAP-P:5′-CTCCGCCTGCTTGGCTGCAAGCGTG-3′。

　　1.4 L基因SAP区域的突变将表达质粒pcDNA3.1(+)用引物pCD-AflⅡ-F和pCD-PacⅠ-R进行扩增,得到目的基因片段,同时将重组质粒prA-FMDV经PacⅠ+AflⅡ双酶切后,与上述得到的目的基因片段连接转化至JM109感受态细胞中。把测序鉴定为阳性的克隆命名为pCD-OL。以pCD-OL为模板,用磷酸化突变引物F-P和SAP-P进行PCR扩增,纯化回收PCR产物,经室 温连接5min后,转化大肠杆 菌JM109。测序鉴定点突变后的阳性克隆,将其命名为pCD-OL-SAP。

　　1.5含有SAP突变的重组质粒的构建

　　将pCD-OL-SAP与prA-FMDV分别用PacⅠ+AflⅡ双酶切后,纯化回收含有L基因SAP区域突变后的目的基因,将其替换到prA-FMDV上,连接转化至JM109感受态细胞中。酶切、测序鉴定为阳性的克隆被命名为prA-SAP-FMDV。

　　1.6 重组病毒拯救重 组 质 粒prA-SAP-FMDV在 脂 质 体Lipo-fectamine 2000的介导下转染BHK21细胞,同时设立prA-FMDV以及正常细胞对照,将其在含有50mL/L CO2的37 ℃培养箱中培 养4~6h后,用MEM培养基替换转染培养基,继续培养观察细胞病变,待细胞出现90%左右病变时收获病毒。反复冻融3次后再次接种BHK21细胞,直到病毒能稳定地产生CPE,并将该重组病毒命名为rA-SAP-FMDV。

　　1.7 拯救病毒的鉴定
　　
　　1.7.1 病毒抗原的间接免疫荧光试验(IFA) 将收获的细胞毒接种至底部有载玻片的生长BHK21细胞的6孔板里,置于含50mL/L CO2的37℃培养箱中,按常规方法做间接免疫荧光试验。一抗为A型FMDV家兔阳性血清,二抗为FITC标记的山羊抗家兔IgG(Sigma公司),同时设立亲本毒株rA-FMDV转染细胞对照和正常细胞对照。

　　1.7.2 遗传稳定性的检测收集连续传至第10代和第15代的细胞毒及接种亲本毒rA-FMDV的细胞,用RNeasy Mini Kit提取总RNA,然后用RT-PCR扩增含有L基因SAP区域突变的目的基因,并将PCR产物纯化回收后送上海桑尼生物技术公司测序。

　　1.8 生物学特性的测定
　　
　　1.8.1 对 BHK21 细 胞 的 毒 力 (TCID50) 将BHK21细胞在37℃含50mL/L CO2的培养箱中培养,待细胞单层长到90%时备用。用MEM以10倍稀释病毒液,将各稀释度(10-3.0~10-8.0)的病毒液分别加入细胞培养瓶,每个稀释度4瓶,同时设立亲本重组毒为阳性对照及空白阴性对照。放入37℃含有50mL/L CO2的培养箱中进行培养,观察3d,用Reed-Muench法计算对BHK21细胞的半数感染量(TCID50)。

　　1.8.2 对乳鼠的毒力(LD50) 将在BHK21细胞上传代稳定的细胞毒用PBS缓冲液10倍系列稀释,每个稀释度(10-4.0~10-9)经颈背部皮下接种2~4日龄乳鼠,每个稀释度各接种4只,接种剂量为每只200μL,同时设立亲本重组毒作为阳性对照组及PBS空白对照组,连续观察7d。记录乳鼠的发病及死亡情况,用Reed-Muench法计算LD50。

　　2 结果
　　
　　2.1 重组质粒pCD-OL的鉴定质粒pcDNA3.1(+)经过特异性引物扩增后与重组质粒prA-FMDV分别用PacⅠ+AflⅡ双酶切,构建含有5′UTR和L基因的重组质粒,获得的阳性质粒经PacⅠ+AflⅡ双酶切鉴定后出现与预期结果相符的片段。

　　2.2 含有SAP突变的重组质粒的鉴定

　　将经过点突变的质粒pCD-OL-SAP用PacⅠ+AflⅡ双酶切后替换到prA-FMDV上构建得到SAP区域突变 的重 组质 粒。获 得 的 阳 性 质 粒 用PacⅠ+AflⅡ双酶切鉴定,结果出现与预期相符的片段。测序鉴定结果显示,该重组质粒中L基因上SAP区域已被成功突变。

　　2.3 重组病毒的拯救

　　脂质体介导转染后第72小时,接种rA-SAP-FMDV的BHK21细胞和接种rA-WT-FMDV的BHK21细胞均出现了明显的CPE,细胞变圆。收取转染细胞上清液继续传代,直至出现CPE的时间缩短,病变更加典型(见图1)。
　　
　　2.4 拯救病毒的鉴定

　　2.4.1 病毒抗原的IFA 检测接种重组毒株rA-SAP-FMDV的BHK21细胞和接种亲本毒rA-WT-FMDV的BHK21细胞中均有特异性绿色荧光,而正常细胞对照无可见荧光产生(见图2),这说明接种传代毒的细胞中有病毒的存在。

　　2.4.2 遗传稳定性的检测收集传至第10代和第15代的重组毒rA-SAP-FMDV以及传至第15代的亲本毒rA-WT-FMDV,用RNeasy Mini Kit提取RNA后经RT-PCR扩增含有L基因SAP区域的基因片段。测序结果(见图3)显示,拯救的重组病毒L基因SAP区域成功突变,且能够稳定遗传。
　　
　　2.5 拯救病毒的生物学特性
　　
　　2.5.1对 BHK21细胞的适应性及毒力(TCID50)拯救病毒rA-SAP-FMDV可使BHK21细胞产生明显的CPE。经Reed-Muench法计算,拯救病毒rA-SAP-FMDV的TCID50/mL是10-7.17,比亲本毒rA-WT-FMDV的TCID50/mL(10-7.5)略低(见图4)。

　　图4重组毒株rA-SAP-FMDV和亲本毒株rA-WT-FMDV的半数感染量(TCID50/mL)Fig.4 The median tissue culture infection dose(TCID50/mL)of the recombinant virus rA-SAP-FMDV and the par-ent strain rA-WT-FMDV
　　
　　2.5.2 对乳鼠的毒力(LD50) 接种拯救病毒和亲本毒的乳鼠在接种后第24小时,部分表现出呼吸困难、后肢麻痹和用镊子夹尾声音嘶哑等症状。

　　72h后出现症状的乳鼠陆续死亡,阴性对照组乳鼠正常。

　　最后根据统计结果计算出拯救病毒rA-SAP-FMDV的LD50为10-6.5/0.2mL,比 亲 本 毒 株rA-WT-FMDV的LD50(10-7.5/0.2mL)略低(见图5)
　　
　　3 讨论

　　本研究获得了FMDV L蛋白酶编码基因SAP区域突变的毒株rA-SAP-FMDV。经测定,该重组毒株具有很高的效价。重组病毒rA-SAP-FMDV从第5代到第9代效价(TCID50/mL)稳定在7.17以上,这与亲本毒株rA-WT-FMDV的7.5相当。rA-WT-FMDV是利用反向遗传操作技术将流行毒株的P1基因替换到本实验室保存的O型口蹄疫病毒拯救系统骨架上的。因此,该重组毒株能够很好地与流行毒株进行抗原匹配。这一突变SAP的A型口蹄疫病毒的获得,将为A型FMD疫苗的研制奠定基础。

　　FMD疫苗有很多类型。可是,不论是哪种疫苗都需要7d左右的时间来诱导产生免疫保护。曾有减毒活疫苗免疫可以引起快速、持久的免疫保护的报道,比如天花和牛瘟的消灭都是通过减毒活疫苗完成的。FMDV研究中也一直在探索研制能够诱导快速、持久的免疫保护的疫苗。国外的研究人员曾构建了L蛋白酶编码基因SAP保守域突变的FMDV毒株,用该突变毒株免疫动物,在免疫后早期(免疫后第2~3天)就可明显提升中和抗体水平,同时免疫早期能够抵抗野生型FMDV的攻击;而亲本毒株免疫早期中和抗体没有变化,同时免疫早期不能够抵抗野生型FMDV的攻击。因此,重组病毒rA-SAP-FMDV的获得,将为以后研制免疫应答迅速的A型FMD疫苗提供生物材料。

　　FMDV感染猪时,病毒会诱导一个免疫抑制阶段以及对应的病毒血症。已有的研究表明,SAP突变的毒株在体内、体外试验中都表现毒力减弱的特征。笔者曾用本研究拯救的重组病毒rA-SAP-FMDV免疫猪,即使用100倍剂量的引起发病的自然毒株来攻击猪,都不会引起临床症状、毒血症或者是带毒现象。可见,该毒株对猪具有很高的生物安全性。突变毒株存在的一个主要问题是遗传稳定性差,尤其是对于FMDV,病毒RNA复制错配率高,并且有大的准种库。笔者通过细胞传代证明,SAP突变株至少在15代以内遗传稳定。