研究FMR1基因敲除雌鼠生殖功能的变化及机制

　　脆性X综合征（fragileXsyndrome，FXS）是常见的X连锁先天性智力低下疾病，FMR1（fragileXmentalretardation1，FMR1）基因的突变或缺失可导致FXS。FMR1基因敲除小鼠（KO鼠）与FXS患者有很多相似的症状，包括不同程度的智力低下、巨睾症等，是研究FXS成熟的动物模型。

　　神经肽Y（neuropeptideY，NPY）是一种含36个氨基酸的单链肽，与下丘脑神经内分泌功能密切相关，在生殖功能起重要调节作用。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）是中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质，对下丘脑-垂体-卵巢轴有深刻的影响，参与生殖活动的调节。

　　研究发现FXS女性20%会出现卵巢早衰，而在KO鼠的繁殖过程中亦发现其繁殖能力有改变。

　　因此，我们旨在研究FMR1基因敲除雌鼠生殖功能的变化，并对其可能的机制进行探究。

　　1、材料与方法

　　1.1材料

　　FMR1基因敲除小鼠（FVBKO）是以正常野生型FVB（FVBWT）小鼠为背景，利用基因敲除技术将FMR1基因定点灭活制备成人类脆性X综合征的代表性实验动物模型。该基因敲除模型鼠于2002年由广州医学院神经科学研究所从荷兰Erasmus大学实验动物科学中心引进，经广州医学院实验动物中心繁育饲养建立了该品系的清洁级种群。所有实验动物的操作及饲养均符合国家标准，遵循人道原则。实验小鼠均饲养在清洁级环境中，自由进水和饮食，室内温度为20~26℃，相对湿度为50%~70%，光照明暗交替12h∶12h。出生后5~7周为小鼠性成熟期，8~12周为小鼠繁殖适龄期，本研究选择10周雌性小鼠为研究对象。

　　1.2主要试剂与设备

　　PCR试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），兔抗鼠NPY多克隆抗体（Abcam），豚鼠抗鼠GABA多克隆抗体（Abcam）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG二抗及羊抗豚鼠IgG二抗（福州迈新生物技术开发有限公司），小鼠血清NPYELISA试剂盒（广州市鲁诚生物科技有限公司），光学显微镜（日本Olympus-BH22），酶标仪（芬兰Thermo）。

　　1.3实验动物基因型鉴定

　　按文献的方法。

　　1.4繁殖力试验

　　选取成年的KO纯合子、KO杂合子及WT雌鼠分别与成年的WT雄鼠合笼，合笼比例为雌鼠：雄鼠=2∶1，每天早上八点和下午两点观察雌鼠是否有孕栓形成，记录合笼时间和产仔数。

　　1.5卵巢形态学观察

　　HE染色观察卵巢形态及卵泡计数，卵泡计数方法参照文献。

　　1.6免疫组化法测定下丘脑NPY、GABA的表达

　　免疫组织化学染色方法按试剂盒操作说明书进行，DAB显色，以PBS代替一抗作为阴性对照，相同条件下已知阳性片作阳性对照，高倍光镜下观察切片（×400），用ImageProPlus6.0图像分析软件分析其平均光密度值。平均光密度值越大，阳性表达越强。

　　1.7ELISA法测定血清NPY水平

　　按ELISA试剂盒说明书步骤进行。

　　1.8统计学处理

　　所有的数据采用SPSS16.0软件进行分析，正态分布的计量资料以（x±s）表示，组间均数采用单因素方差分析。P<0.05为差异有显著性。

　　2、结果

　　2.1实验动物基因型鉴定结果

　　KO鼠和WT鼠分别扩增出约800bp和468bp的DNA片段，见图1。

　　2.2繁殖力试验结果

　　3组小鼠合笼天数及产仔数比较，KO纯合子雌鼠产仔数少于WT雌鼠（P<0.05），见表1。

　　2.3卵巢组织形态比较

　　KO纯合子、KO杂合子、WT雌鼠卵巢形态未见明显不同，见图2；KO纯合子雌鼠卵泡总数少于WT雌鼠（P<0.05），见表2。

　　2.4下丘脑NPY的表达及其平均光密度值比较

　　NPY在下丘脑的表达结果，见图3；KO纯合子雌鼠下丘脑NPY的表达弱于WT雌鼠，差异有显著性（P<0.05），见表3。

　　2.5下丘脑GABA的表达及其平均光密度比较

　　GABA在下丘脑的表达结果，见图3；三种基因型小鼠下丘脑GABA的表达差异无显著性（P>0.05），见表3。2.6血清NPY表达的比较3组小鼠血清NPY的表达量差异无显著性（P>0.05），见表4。

　　3、讨论

　　FXS是X连锁不完全显性遗传病，发病率男性为1/1250，女性为1/2500，在X连锁智力低下中占40%，99%的FXS是由于脆性X智力低下基因1（FMR1）的动态突变引起，1%是由于FMR1基因的错义突变或缺失突变引起。FMR1基因位于X染色体的长臂远端Xq27.3区的脆性部位，含17个外显子，在该基因的5‘非翻译区存在一段数目可变的（CGG）n重复序列，其上游250bp处存在一CpG岛。（CGG）n结构的重复扩增会造成CpG岛的异常甲基化，从而关闭FMR1基因的转录，导致其编码的脆性x智力低下蛋白（FMRP）的表达减少或缺失，进而引起一系列的临床表现，主要表现为智力低下、自闭症、认知障碍、女性成年期卵巢早衰及男性青春期后大睾丸。FMR1基因敲除小鼠是在FMR1基因的第5个外显子中插入了一个新霉素表达片断，从而阻断了500bpDNA片断的扩增，导致FM-RP表达的缺失而制备成FXS的动物模型，其活动过度，学习记忆力减退，易激惹，青春期后睾丸增大，是研究FXS成熟的动物模型。

　　近年来已有文献报告FMR1基因的缺失对小鼠的生殖功能有影响，祝亚桥等研究发现KO雄鼠的生育能力和WT小鼠相比是降低的，但两者的精子生成量、精子存活率、精子畸形率及血清性激素水平无差别，考虑为KO雄鼠的脑部病变，或与勃起相关的因素改变而引起。在对雌性FMR1基因敲除小鼠生殖功能的研究中戴丽军等应用10u孕马血清促性腺激素（PMSG）和10u人绒毛膜促性腺激素（HCG）对10周的FVB.KO和FVB.WT雌鼠超排卵处理后，血清性激素水平和超排卵数差异均无显著性（P>0.05），提示超排不影响FMR1基因敲除小鼠的繁殖性能。同时该研究发现FVB.KO的产仔数较FVB.WT是降低。以上的研究均提示FMR1基因的缺失降低了小鼠的生育率，但对其影响机制未作进一步的研究，本实验除了应用产仔数这一传统指标对FMR1基因敲除小鼠的繁殖性能进行评估外，更运用了卵泡计数这一更直观的证据加以说明，在他们研究的基础上本实验着重探讨FMR1基因是通过何种机制来影响小鼠的生殖功能的。

　　本研究显示成年的KO纯合子、KO杂合子、WT雌鼠与成年的WT雄鼠合笼，KO纯合子雌鼠的产仔数少于WT雌鼠，P<0.05，这与前人的研究结果相同。HE染色观察3种基因型雌鼠的卵巢形态发现：

　　卵巢皮质、髓质层次分明，原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡及黄体均可见，原始卵泡、次级卵泡较多，另可见少量闭锁卵泡及间质腺，3组间其卵巢形态未见明显不同。3组间卵泡总数比较发现：KO纯合子雌鼠的卵泡总数少于WT雌鼠，P<0.05。卵泡数目是反映卵巢储备的重要的指标，卵泡数目的减少标志着生殖功能的下降。这一结果同样支持KO纯合子雌鼠的生育功能是下降的，而实验未发现KO杂合子雌鼠的生殖功能有下降，这说明FMR1基因的完全缺失可能才会影响其生殖功能，其具体机制有待于进一步研究。

　　KO纯合子雌鼠的生育功能是下降的，那么FMR1基因是通过何种途径来调节其生殖功能的呢？NPY是一种含36个氨基酸的单链肽，与下丘脑神经内分泌功能等生理过程的调节密切相关，NPY可影响下丘脑-垂体-卵巢轴的活动，对排卵前LH峰的形成有促进作用，NPY表达的下降可引起LH峰形成不良，从而影响排卵。NPY还可影响Ca2+的浓度而调节卵巢的血流，从而影响卵泡的发育。本研究发现在KO鼠的中枢神经系统中，下丘脑室周核、正中隆起、下丘脑外侧区、弓状核、背侧区及腹内侧核均可见NPY阳性细胞的表达，正中隆起、下丘脑弓状核及背侧区这些与生殖调节密切相关的区域，其NPY表达更强烈，3种基因型雌鼠其NPY表达部位无明显不同，经统计，KO纯合子雌鼠下丘脑NPY的表达弱于WT雌鼠，这提示FMR1基因可能是通过下调NPY的表达来调节雌鼠生殖功能的。

　　GABA是中枢神经系统重要的抑制性神经递质，通过下丘脑-垂体-性腺轴影响垂体和性腺的生理机能，也可以通过多巴胺系统抑制LH和PRL的分泌，对生殖功能有重要的调节作用。本研究发现GABA阳性细胞在下丘脑弓状核、室周核、腹内侧核背部和腹部以及下丘脑背侧区均有表达。在下丘脑弓状核和室周核GABA表达更强烈，3种基因型雌鼠其GABA表达部位未见明显不同。经统计，3种基因型雌鼠其下丘脑GABA的表达量差异亦无显著性，提示FMR1基因可能不是直接调节GABA来影响其生殖功能的，而可能是通过GABA受体信号通路。

　　NPY和GABA在下丘脑均有表达，且在弓状核两者表达均更强烈，NPY和GABA均可调节生殖功能，但NPY和GABA是否可以相互调节从而影响生殖功能，还有待于进一步的研究。本实验初步探讨了FMR1基因的缺失对雌鼠生育功能的影响，下一步将研究FMR1基因是如何调控NPY的表达及GA-BA受体信号通路在KO鼠中的作用。
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