基于小鼠模型探析哮喘的发病机制(2)

　　按随机数字表法将 40 只小鼠分为对照组、哮喘组、布地奈德干预组、雷帕霉素干预组，每组10 只。模型制作参照文献[4]并加以改进：哮喘组、布地奈德干预组、雷帕霉素干预组小鼠均于第1、8、15 天用 OVA（100 μg）+ 氢氧化铝（1 mg）混悬液0.2 mL 腹腔注射行基础致敏，对照组用生理盐水0.2 mL 代替；自第 22 天开始，用 2% OVA 雾化吸入进行激发，每日 1 次，共 10 次，对照组以生理盐水代替 OVA 进行激发；每次激发前 30 min,雷帕霉素干预组给予雷帕霉素 3 mg/kg 腹腔注射，布地奈德干预组给予雾化吸入 1 mg 布地奈德混悬液，而哮喘组和对照组均给予等量生理盐水进行替代。末次激发 24 h 后颈椎脱臼处死小鼠，打开胸腔，用改良后的 22 G 留置针行气管插管，结扎左侧主支气管，以磷酸盐缓冲液灌洗 0.5 mL×3 次，收集肺泡灌洗液（BALF）并混匀。收集的 BALF 离心后取上清液于 -80℃冰箱内保存待测。
　　
　　1.3 小鼠 BALF 中 HIF-1α 及 VEGF 含量测定采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定 HIF-1α、VEGF的表达，实验步骤按试剂盒说明书进行。
　　
　　1.4 肺组织病理改变。
　　
　　取肺组织常规制作石蜡切片后，行苏木精 -伊红（HE）染色，显微镜下观察肺组织病理改变。
　　
　　1.5 免疫组化染色检测各组小鼠肺组织 p-mTOR及 p-4EBP1 的表达。
　　
　　取肺组织常规制作石蜡切片，采用链霉菌抗生物素蛋白 - 过氧化物酶连结法进行检测。
　　
　　p-mTOR、p-4EBP1 以细胞质或细胞核出现棕黄染色判定为阳性细胞，采用软件（Image-pro Plus 6.0）测定 p-mTOR、p-4EBP1 阳性表达的总积分光密度值（IOD），每份标本随机取 3 张切片，每张切片随机观察5个高倍镜视野，取其平均值为表达结果。
　　
　　1.6 Western blot 法 检 测 各 组 小 鼠 肺 组 织p-mTOR 及 p-4EBP1 的表达。
　　
　　取 200 mg 肺组织用 RIPA 细胞裂解液研磨裂解并离心，取上清液测蛋白浓度。样本经 SDS-PAGE电泳分离后转移至硝酸纤维素滤膜上，经5%脱脂奶粉 PBST 溶液室温下封闭 2 h 后分别加入一抗、二抗孵育。洗膜后暗室中加ECL发光试剂曝光、显色。应用 β-actin 作为内参照，结果以目的蛋白与内参蛋白表达比值表示。
　　
　　1.7 统计学分析。
　　
　　采用 SPSS 21.0 统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数 ± 标准差（x±s）表示，多组间的比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析，组间两两比较采用 SNK-q 检验；相关分析采用 Pearson 直线相关分析，P<0.05 为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果。
　　
　　2.1 ELISA 法检测各组小鼠 BALF 中 HIF-1α 及VEGF 水平。
　　
　　哮喘组小鼠 BALF 中 HIF-1α、VEGF 水平均显着高于对照组、布地奈德干预组及雷帕霉素干预组（P<0.01），而对照组与两干预组间相比，HIF-1α、VEGF水平差异无统计学意义（P>0.05），见表1.
　　 　　2.2 各组小鼠肺组织病理学改变。
　　
　　对照组小鼠肺组织 HE 染色示支气管壁结构光滑完整，上皮细胞排列整齐，气道壁厚度适中，少量炎性细胞浸润；哮喘组小鼠肺组织 HE 染色示气管及其周围炎性细胞尤其是嗜酸性粒细胞等浸润明显，黏膜下水肿，皱襞增多，黏液分泌物增多，气道平滑肌肥大，管壁及基底膜增厚不规则。而布地奈德干预组及雷帕霉素干预组小鼠肺组织上述病理改变明显减轻。以上差异提示建立哮喘模型成功，且干预治疗有效。见图 1.