树突状细胞抗真菌免疫机制与应用

　　引言

　　侵袭性真菌感染是临床上非常棘手的问题，致死率可高达30%~50%[1].然而，真菌在人类感染的所有病原体中研究最少[1].尽管近二十年体内抗真菌药物研究有了较大发展，但真菌病原体感染致死率依然不断提升，主要是因为这类患者免疫力多数受到抑制，比如艾滋病患者、器官移植受体、肿瘤患者等。曲霉菌、白色念珠菌、新型隐球菌三大机会致病菌对免疫力缺陷或抑制的患者来说是致命的威胁[2-4].研究表明[5],发展抗真菌的疫苗将给免疫缺陷或抑制的患者带来福音，免疫疫苗治疗有望成为临床上抗真菌感染的新策略。

　　树突状细胞（dendritic cell,DC）是抗原递呈能力最强的抗 原 提 呈 细 胞 （antigen presenting cell,APC）[6].DC疫苗抗肿瘤的临床试验在2010年4月29日得到美国食品药品管理局（Food and DrugAdministration,FDA）的批准[7].美国洛克菲勒大学教授Ralph M.Steinman因“发现树突状细胞及其在获得性免疫中的作用”而获得2011年的诺贝尔生理学或医学奖[8].机体抵抗和清除真菌依赖于固有免疫应答和获得性免疫应答的调动和相互协调[9],而DC就是在固有免疫应答和获得性免疫应答中扮演中间人的角色，也是唯一的活化初始T细胞的抗原提呈细胞[10].DC通过启动和协调辅助性T淋巴细胞（T help,Th）、调节性T淋巴细胞（regulatorycell,Treg）及效应性T细胞的应答，以调动固有免疫和适应性免疫发挥抵抗清除真菌的作用[10-11].本文将对DC的抗真菌免疫机制，抗真菌的靶向DC疫苗策略及其研究进展进行综述。

　　1 DC的抗真菌免疫机制

　　过去100年，对哺乳动物免疫学的研究认识取得较大进展，但对抗真菌免疫机制的认识是在近几年才有了重大的突破[12].机体抵抗不同真菌的有效应答依赖于不同的免疫应答机制，而DC在这些机制中均表现出惊人的功能可塑性。

　　1.1固有免疫：模式识别受体与DC

　　固有免疫和适应性免疫对抗真菌的感染主要依赖于吞噬细胞（主要为DC）对病原体的吞噬清除，而固有免疫是机体抵抗真菌感染的第一道防线[1].DC对真菌病原体的清除首先依赖于形形色色的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）对保守性真菌病原体相关分子模式（pathogen-associ-ated molecular patterns,PAMP）的识别。

　　PRR识别真菌病原体之后，可激活细胞内的信号传导通路诱发DC的迁徙、成熟以及分泌细胞因子产生免疫应答。另外，PRR还可以调节DC对真菌的摄取，引导真菌进入DC内部合适的位置进行抗原加工和呈递。

　　PRR主要包括Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）家族，C型凝集素受体（C-type lectin recep-tors,CLR）家族和Nod样受体（Nod-like receptor,NLR）[11].TLR识别PAMP涉及到细胞内信号转导通路的激活，包括最终转录因子AP-1和核因子-κB（nu-clear factor-kappa B,NF-κB）的激活。大量的研究表明，真菌的识别主要依赖于内核酸敏感的TLR,包括TLR3、TLR7和TLR9[13].所 有TLR家 族（TLR3例外）识别PAMP都是通过TLR介导的MyD88髓分化的初级应答。由于MyD88对Th1的启动作用，现已普遍认为TLR对真菌的识别诱导了Th1的应答。与TLR类似，CLR也可识别大多数真菌PAMP（包括葡聚糖分子、甘露糖分子、海藻糖分子）并激活免疫受体酪氨酸激活基序（immuno-receptor tyrosine-based activatory motif,ITAM）的胞内信号转导通路以诱导DC的成熟和细胞因子的分泌[14].比如，CLR中DC相关的Dectin-2家族能直接或间接地调整胞内信号传导，识别各种各样的内源或外源性的配体以识别真菌[15].最近的动物和人体研究也表明，CLR的多态性或者基因突变与真菌的易感性具有重大的相关性[16].对于NLR而言，NLRP3和NLRC4在抗真菌感染的免疫机制中发挥着重要作用，但具体这些炎症小体是如何被真菌激活的却不得而知[12].

　　1.2适应性免疫

　　Th17与适应性免疫。机体对真菌的适应性免疫应答可分为细胞免疫和体液免疫。体液免疫对机体抗真菌的作用在最近几年才有了肯定[17-18],但细胞免疫的抗真菌机制早已有所认识，它主要依赖于吞噬细胞的PRR对真菌病原体的识别以及细胞因子和趋化因子的分泌[1].

　　事实上，特定PRR对真菌的识别与特定类型的适应性免疫应答有着直接的联系，比如Th1的适应性免疫应答与TLR4直接关联，Th2的适应性免疫应答与TLR2直接关联[19].最新研究表明，CLR与NLR对真菌的识别可以诱导Th17的免疫应答，这些机制的发现对于设计抗真菌的疫苗有着重大的意义[11-12].值得注意的是，以IL-17分泌为主要特征的Th17免疫应答主要是负责黏膜上的抗真菌作用。虽然其中的机制还有待进一步阐述，但可能涉及局部中性粒细胞的聚集和抗菌肽的产生。

　　IL-17是诱导粒细胞生成和中性粒细胞趋化的最主要的细胞因子，也可以通过提高粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimula-ting factor,G-CSF）和CXC趋化因子在黏膜上皮细胞以及局部基质的表达而间接激活中性粒细胞[20].最近人体试验也表明，Th17免疫缺陷与黏膜和皮肤的真菌易感性有着直接的联系，尽管动物实验表明Th17应答中炎症也可以诱导病理发展和机体易感性。

　　2靶向DC的抗真菌策略

　　鉴于靶向DC抗真菌的疫苗策略在初期实验中表现出了巨大潜力[21-23],以及DC在抗真菌的免疫机制中的独特地位和中心性作用[1,3,19],基于DC的抗真菌疫苗极具开发前景。随着抗原提呈技术的进步以及对DC生物特性的深入了解，靶向DC在体外的抗原有效装载已经成为可能。

　　2.1给药途径

　　DC广泛存在于皮肤、肺和小肠，因而这些部位的DC靶向策略更具潜力。一项控制疫苗给药路径的开放性研究表明，对于18~60岁的受试者，与皮下注射相比，经皮内注射能诱发强度近两倍的抗体应答[24].另一非临床试验表明，疫苗经阴道给药可以很快清除小鼠体内的假丝酵母菌，而且能有效地防止复发[25].然而，针对上述部位的DC靶向策略治疗也并非通用的抗真菌疫苗的给药途径。比如，皮炎芽生菌的减毒活疫苗在皮下给药的时候能发挥完整的保护作用，而经鼻内给药抵抗肺内致死感染却没有效果。

　　组织的微环境也会调节DC亚群的功能，从而影响有效的T细胞应答。脾内DC亚群可以在没有IL-6的情况下诱发Th17分化，而来自皮肤和小肠的DC则必需IL-6诱发Th17的分化[26].所以，在设计抗真菌疫苗给药途径的时候，应考虑注射途径局部细胞因子的分泌和DC亚群特性等因素。

　　2.2抗真菌DC疫苗的构建方法

　　构建抗真菌DC疫苗的经典方法是通过体外真菌RNA转染DC来实现，可以诱发保护性T细胞反应，还可以加速保护性Th1分泌干扰素-γ的增多，但这种方法结果具有真菌特异性，并未观察到跨菌种的交叉保护[11].另外，此方法耗时、昂贵，在临床推广应用的可能性不大。另一种直接而有效的抗真菌DC疫苗构建方法是将抗原共价连接于特异性DC的配体上。真菌病原体一般都含有甘露糖基化的蛋白，而甘露糖基化的蛋 白 则 能 有 效 地 被DC通 过CLR识 别 吞 噬。

　　Lam等[27]发现，模型抗原OVA（ovalbumin,OVA）的甘露糖基化可以大大增强其免疫原性，至少DC通过CLR家族CD206和CD209对其进行摄取的能力得到明显加强。其他糖类分子同样可以有效地将特异 性 抗 原 呈 递 给 靶 向DC.相 比 于 可 溶 性 的OVA,OVA负载的β糖类颗粒能使靶向DC在体内诱导OVA特异性CD4+和CD8+ T细胞增殖更具优势[28].

　　还有一种抗真菌DC疫苗构建是通过纳米颗粒的使用而得以实现。纳米颗粒与DC的靶向构建依赖于纳米颗粒本身的亚微粒大小以及DC表面的受体或者能结合独特受体的抗体结构。纳米颗粒介导的靶向DC在最近的研究中体现出明显的优越性。Tacken等[29]的研究表明，纳米颗粒可以有效地构建靶向DC,纳米颗粒与佐剂的共同递送可诱发强烈的免疫应答且毒性较小。

　　2.3可行性分析

　　真菌表面覆盖有多聚糖、糖类分子以及糖复合抗原，是抗真菌疫苗构建的基础。然而，真菌表面糖复合抗原的免疫原性尚不可预知，其半数糖类分子并不能被T细胞直接识别。随着新技术的出现，真菌表面一部分能被T细胞直接识别的糖复合物表现出极强的免疫原性，使得抗真菌疫苗的设想成为可能[30].另一方面，早前的研究已经表明，糖基化多肽的免疫反应可以诱发糖类特异性的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）应答，经适当处理过的糖复合物可以被加工和呈递给CD8+T细胞[30].由于DC的交叉呈递，设计抗真菌DC疫苗以期产生真菌糖类特异性的CTL应答来达到抗真菌效果有望实现。

　　3结语

　　本文论述了DC抗真菌疫苗策略及其可行性研究进展。随着对抗真菌免疫机制的认识日益加深，以及基于DC的靶向疫苗技术日益成熟，新疫苗的构建显示出免疫应答良好且毒性较小的优越性。DC作为固有免疫和适应性免疫的中心抗原提呈细胞，在抗真菌疫苗中的应用将指日可待。

　　参 考 文 献

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