丁酸对树突状细胞免疫作用的影响

　　人及动物肠道内的短链脂肪酸（ Short-chain fat-ty acids,SCFAs） 是肠道内正常微生物群的代谢产物，是维持肠道正常生理功能和肠道免疫稳态的重要因素。丁酸盐作为肠道内最丰富的、具有生物活性的短链脂肪酸，不但是小肠上皮细胞的营养因子，维持上皮细胞的生长[1,2],而且还能够阻止结肠癌细胞的细胞周期循环和诱导结肠癌细胞凋亡[3].

　　同时，作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（ Histonedeacetylase inhibitor,HDACi） ,丁酸盐也具有潜在的免疫调节作用[4].在细胞内，组蛋白乙酰化受组蛋白乙酰转移酶（ Histone acetyltransferases,HATs） 和组蛋白去乙酰化酶（ Histone deacetylases,HDACs） 调节。组蛋白乙酰化能够引起细胞核染色质扩张，并且增强调控蛋白与 DNA 的亲和力，而组蛋白去乙酰化则会引起核染色质缩合和转录阻遏[5].HDACi对肿瘤细胞的效应已有明确报道。HDACi 可通过改变基因的转录阻止肿瘤细胞的生长、分化，从而诱导细胞凋亡[6].近期的研究报道也表明，HDACi 有抗血管增生和免疫调节的作用，可使一些免疫性疾病和炎性疾病的体征得到改善，如可很大程度缓解系统性红斑狼疮（ SLE） 的蛋白尿、肾小球肾炎等[7].

　　树突状细胞（ DCs） 是体内重要的抗原提呈细胞，在免疫系统中起重要的作用。鉴于 DCs 细胞表型与功能的可塑性，我们推测有去乙酰化酶抑制剂效应的代谢产物丁酸等短链脂肪酸可能具有调节 DCs细胞特性的功能，并参与体内免疫稳态的维持。因此，本研究中以体外培养的骨髓源 DCs 细胞作为研究对象，探讨了丁酸对 DCs 细胞的免疫调节功能，并对其可能机制做了初步的探讨。

　　1 材料与方法

　　1. 1 实验动物 6 ~ 12 周龄的雌性 C57 /BL6 小鼠（ 购自扬州大学比较医学中心） ,6 ~ 12 周龄的H2kb-OVA257-264 肽抗原特异性的 OT1 小鼠购自Jackson Lab 后，本室繁育后用于实验。

　　1. 2 主要试剂和仪器 丁酸钠盐（ Sigma 公司） ,高糖 DMEM 培养基、胎牛血清（ PAA 公司） ,6 孔板、24孔板、96 孔板（ Nunc 公司） ,脂多糖（ LPS,Sigma 公司） ,卵清蛋白（ OVA,Sigma 公司） ,总 RNA 提取试剂 Trizol（ TaKaRa 公司） ,逆转录试剂盒（ Invitrogen公司） ,SYBR Green 荧光染料（ TaKaRa 公司） ,CFSE荧光染料（ Invitrogen 公司） ,RIPA 裂解液（ TaKaRa公司） ,CD11b-FITC、CD11c-Biotin-cy5. 5、CD80-PE、CD86-PE、MHC-Ⅱ-FITC、B7-DC-FITC、TLR4-Biotin-cy5. 5、CD8-Biotin-cy5. 5、CD8-PE （ eBioscience 公司） ,磁分选试剂盒（ Stem cell 公司） ,7-AAD（ eBio-science 公司） ,p-erk 和 t-erk 抗体 （ eBioscience 公司） ,超净工作台（ 苏州净化厂） ,二氧化碳培养箱（ Forma 公司） ,倒置式生物显微镜（ Nikon 公司） ,PCR 仪 （ Bio-Rad 公司 ） ,台式离心机 （ Thermo 公司） ,CFX96 定量 PCR 仪（ Bio-Rad 公司） ,FACS Cal-ibur 流式细胞仪或 BD Accuri C6 流式细胞仪（ BD 公司） .

　　1. 3 小鼠骨髓源树突状细胞（ BMDCs） 的体外培养参照文献[8]进行。简述之，将 C57/BL6 小鼠处死后，取股骨与胫骨。用无菌 PBS 液冲洗骨髓腔，制备骨髓细胞。将骨髓细胞用含 10% FCS、GM-CSF（ 10 ng/ml） 、IL-4 （ 1 ng/ml） 的 DMEM 培养基在37℃ 、5% CO2条例下进行培养 7 d 后，收获并纯化CD11c+细胞，作为不成熟 BMDC 细胞。将加入 LPS（ 终浓度为 1 μg/ml） 的细胞作为成熟 BMDC 细胞。

　　1. 4 丁酸对 BMDCs 膜表面共刺激分子和 MHCⅡ的影响 将诱导培养 7 d 的 BMDC 细胞，按每孔 5×105细胞加入到 24 孔板中，分别加入 LPS 或丁酸盐（ 终浓度 0. 5 mmol/L） 后继续培养 18 h.收集细胞，用大鼠血清封闭 10 min 后，4℃条件下，将细胞液中分别加入荧光素标记的 CD80、CD86、MHCⅡ和 B7-DC 等抗体，标记 15 min.将标记完成的细胞用 PBS液洗二遍后，用流式细胞分析仪检测标记细胞的荧光信号，并用 Flowjo 软件分析。

　　1. 5 丁酸对 BMDCs 分泌 IL-6、IL-12 和 NO 的影响细胞的处理与准备同 1. 4.细胞处理完成后，加入 TRIZOL 裂解 BMDC 细胞，提取其总 RNA.按照逆转录试剂盒说明书将 2 μg RNA 逆转录为 cDNA,以 cDNA 为模板，以 GAPDH 为内参，定量检测扩增IL-6、IL-12 基因的表达。所用引物序列如下： GAP-DH 上游序列 GGCATTGCTCTCAATGACAA,下游序列 TGTGAGGGAGATGCTCAGTG; IL-6 上 游 序 列GAGGAGACTTCACAGAGGATAC, 下 游 序 列GACTCTGGCTTTGTCTTTCTTG; IL-12 上 游 序 列GGTTTGCCATCGTTTTG,下 游 序 列 GGGTCTTTC-CAGAGCCT.Real-time PCR 反应体系： SYBRGreen5 μl、上下游引物各 0. 2 μl、cDNA 模板 0. 5 μl、ddH2O 4. 1 μl,总反应体系为 10 μl. 扩增条件：

　　95℃ 5 s,58℃ 20 s,72℃ 31 s,39 个循环。采用2-△△CT法计算相对基因表达。另外，收集 18h 后的各组上清，按照 Griess reaction 试剂盒说明采用酶标仪检测上清中 NO2-的含量。

　　1. 6 丁酸对 BMDCs 激活抗原特异性 CD8+T 细胞增殖能力的评估 细胞的处理与准备同 1. 4.将BMDCs 用 OVA 抗 原 处 理 6 h. 另 分 离 H2kb-OVA257-264 肽抗原特异性 OT1 小鼠的脾脏，碾磨、破红细胞后用 PBS 洗一次。去上清，留余液混匀，将细胞转移到分选管，加 CD8-Biotin-cy5. 5 抗体，室温 15 min; 加试剂盒中 Biotin Selection Cocktail,室温1管插入分选磁铁中，5 min,弃去液体； 加 PBS 混匀细胞，再重复分选二次。加 PBS 吹打混匀细胞，并转移至离心管，重悬细胞； 加 CFSE 于 37℃、10 min 进行细胞标记。将经 OVA 处理后的各组 DC 与经过CFSE 标记的 CD8+T 细胞共培养，两者细胞比为 2 ×104∶2 ×105,37℃、5% CO2条例下培养 4 d 后，将细胞标记荧光抗体 anti-CD8、7-AAD,流式细胞仪检测CD8+T 细胞增殖情况。