树突状细胞细胞疫苗对膀胱癌皮下移植瘤的免疫作用

　　树突状细胞（DC）具有超强的抗原提呈能力，且能够诱导初始 T 细胞活化，在免疫应答的诱导中具有重要作用[1].近年来，DC 疫苗在实验室中广泛应用于治疗肿瘤的研究[2-3].探讨 DC 2.4细胞疫苗在 MB 49 小鼠膀胱癌皮下移植瘤模型中的免疫学效应。

　　1 材料

　　（1）DC 2.4、MB 49 细胞，受赠于辽宁医学院张佩教授。（2）C 57 BL/6 近交系雌性小鼠 36 只，8 ~ 12 周龄，体重 18 ~ 20 g,雌性，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证编号：SCXK（沪）2012-0005.（3）FITC anti-Mouse CD 4、PE anti-Mouse CD69 购自美国 BD 公司。Anti-CD 4、Anti-CD 8、Goat Anti-RabbitIgG/HRP 购自北京博奥森生物技术有限公司。

　　2 方法

　　2.1 小鼠膀胱癌 MB 49 细胞皮下移植瘤模型的建立将 36 只小鼠按随机数字表法分为 3 组，疫苗组、PBS 对照组和正常对照组。用 PBS 调整对数生长期 MB 49 细胞浓度至 5×106/ml,注射于各组小鼠右前腋皮下，每只 0.2 ml,建立 MB 49 细胞皮下移植瘤模型[4].

　　2.2 疫苗制备与接种冻融法制备 MB 49 粗提全抗原，按原细胞的比例 10:1 负载DC 2.4,制备 DC 2.4 疫苗。调整疫苗细胞浓度至 1×106/ml,各组小鼠分别于建模第 7 d、14 d 给予相应治疗：疫苗组给予疫苗 0.1ml + PBS 0.1 ml,PBS 对照组给予 PBS 0.2 ml,注射于小鼠接种瘤细胞处皮下。正常组正常饲养。

　　2.3 疫苗免疫学效应检测尼龙毛柱法分离各组小鼠脾 T 细胞，RPMI-1 640 调整细胞浓度至 1×107/ml.以 FITC-CD 4 和 PE-CD 69 双标；流式细胞术检测T 细胞 CD 4、CD 69 表达。取分离的 T 淋巴细胞，PBS 调整细胞浓度为 5×107/ml,24 孔板，37℃培养箱培养 48 h,取上清，ELISA法检测 IFN-γ 含量。石蜡包埋瘤组织切片，Envision 两步法免疫组化染色。免疫组化图像分析系统分析，计数CD 4+和CD 8+细胞数。

    2.4 统计学方法应用 SPSS13.0 软件进行数据处理和统计学分析，计量资料采用t 检验，计数资料采用χ2检验，P <0.05,差异具有统计学意义。

　　3 实验结果

　　3.1 流式细胞术检测比较各组小鼠脾 CD 4+、CD 4+CD 69+T 细胞数流式检测小鼠脾 CD 4+、CD 4+CD 69+T 细胞数，疫苗组均高于PBS 对照组和正常组，P < 0.01,差异具有统计学意义，（其中 1组P < 0.05），见表 1.各组取 1 张流式图进行比较，见图 1.

　　3.2 ELISA 法检测比较各组小鼠脾 T 细胞培养上清 IFN-γ 水平脾 T 细胞培养上清 IFN-γ 水平，疫苗组高于 PBS 对照组和正常组，P < 0.01,差异具有统计学意义。见表 2.

　　3.3 免疫组化检测比较各组小鼠瘤组织 CD 4+、CD 8+细胞数免疫组化检测小鼠瘤组织 CD 4+、CD 8+细胞数，疫苗组 CD4+和 CD 8+T 细胞数均高于 PBS 对照组，P < 0.01,差异具有统计学意义。见表 3.

　　4 讨论

　　CD 69 是一个早期淋巴细胞活化的标志，近年的研究表明[5],CD 69 抗原的表达在 T 细胞活化的过程中起重要作用。DC 2.4 疫苗刺激 T 细胞活化和增殖，使脾内 CD 4+、CD 4+CD 69+细胞数增加。DC 2.4 能通过分泌细胞因子和趋化因子趋化 T 细胞，通过血管内皮屏障而增加肿瘤部位的效应 T 细胞数量[6].CD 4+T 细胞在 IL-12 等细胞因子促进下可极化为 Th 1 细胞，Th 1 细胞产生IL-2、IFN-γ 等细胞因子，促进 Th 1 细胞、CTL 的增殖，从而放大免疫效应。CD 8+CTL 通过溶细胞作用直接杀伤肿瘤细胞和通过分泌 IFN-γ、TNF 间接杀伤肿瘤细胞。[图略]