测定白血病细胞Jurkat细胞内谷胱甘肽的含量变化

　　肿瘤已经成为危害人类生命的一种常见疾病, 随着磁疗在临床应用的广泛开展,有关磁场对生物机体抗肿瘤细胞的研究也日益增多.但磁场对生物的影响比较复杂,在不同的磁场强度、温度、照射时间等条件下,生物效应会有所不同.通常较强的磁场会抑制生物的生长,而弱磁场对生物可能具有促进作用,不同种类生物其磁效应结果也会不同. 为进一步探索磁场的生物学效应,我们在 4T 恒定强静磁场作用 1、8h 和 24h 后,采用生物化学DTNB法测定白血病细胞 Jurkat 细胞内谷胱甘肽的含量变化,旨在探讨强静磁场对肿瘤细胞的生物效应,为磁疗在临床医学的应用提供一定实验依据.

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料与仪器

　　1.1.1 材料 ①细 胞系 : 人急性淋巴细胞性白血病细胞株 Jurkat,购于中国科学院上海细胞库. ②试剂和药物:改良型 RPMI-1640培养基(美国 HyClone 公司);胎牛血清(美国 HyClone 公司;谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所). ③主要仪器:UV-1800 紫外可见分光光度计(中国上海美谱达仪器有限公司 );MCO175CO2 培养箱(日本三洋电器).

　　1.1.2 强磁场设备 沈阳工业大学工程电磁场理论与新技术研究所自行开发,国家发明专利号 ZL200710011163,在工作空间中产生竖直方向的稳定超强磁场,磁场中心磁感应强度为 4T,强磁体的工作空间是一个竖立圆柱形通孔,内径 8 mm,长度 150 mm.在工作空间轴心方向上,磁场中心磁感应强度比较均匀. 工作空间的温度为(37±1)℃.

　　1.2 实 验方法

　　1.2.1 细胞培养 急性淋巴细胞性白血病细胞株 Jurkat,培 养于含10%胎牛血清的 RPMI1640 培养液中, 置于 37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中培养,3~4 d 换液一次.

　　1.2.2 细 胞内 GSH 含 量测定 取对数生长期的白血病细胞株 Ju-rkat 细胞,调整细胞数为每毫升 1×106. 实验分组:实验组(磁场照射)、对照组(无磁场照射). 在 37℃条件下,将实验组细胞置于恒强磁场进行照射,对照组细胞不做磁场照射.磁场照射结束后,收集细胞,以 PBS 液洗涤 3 次,用 40Hz 超声波粉碎细胞,以 4000rpm/min,离心 10min 后留取上清,实验按试剂盒说明书操作,显色反应后测定吸光度,使用 UV-1800 紫外可见分光光度计,测定波长为420 nm,1 cm 光 镜 ,双蒸水调零 ,比色测定待测试样的光密度值(OD),并记录空白管、标准管 、实验组和对照组所对应的 OD 值 .实验重复 3 次. 按以下公式计算细胞内 GSH 含量:GSH 含量(gGSH/L)=×标准品浓度×GSH 分子量×样 品稀释倍数,其中标准管浓度(20umol/L).将测定的 OD 值按计算式转换为细胞内含量,单位为 mg/L.

　　1.3 统计学处理

　　统计学分析采用 SPSS 11.0 统计软件,结果以均数标准差(x±s)表示,两样本均数比较采用 t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义.

　　2 结果

　　强静磁场连续照射 1、8h 和 24h 后, 各实验组细胞内谷胱甘肽的含量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),如表 1 所示.不同照射时间组谷胱甘肽含量比较,随照射时间延长,谷胱甘肽含量逐渐降低,但差异无统计学意义.

　　3 讨论

　　谷胱甘肽(Glutataione)是一种由三个氨基酸组成的小分子肽,它作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂,如与自由基、重金属等结合,从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质,排泄出体外. 谷胱甘肽可促进细胞增殖,保护细胞免受氧应激损伤,显示其具有细胞保护、抗氧化和抗纤维化作用[1].谷胱甘肽含量与肿瘤细胞的增殖也有密切的关系,在白血病化疗过程中,谷胱甘肽 S转移酶的高表达的肿瘤细胞出现对化疗药耐药或者不敏感,降低谷胱甘肽的含量可以逆转耐药状态[2-3].静磁场是磁场方向及强度恒定不变的一类磁场强静磁场是强度高于 1 特斯拉的磁场.也有研究发现,0.2~0.4 T 中等强度静磁场对人 T 淋巴细胞白血病细胞曝磁 3 d 后,增殖能力均受到明显抑制[4-5],中强度静磁场也可以抑制肿瘤细胞的生长,诱导肿瘤细胞产生氧化应激,破坏细胞膜结构,促使肿瘤细胞凋亡[6].

　　我们的研究显示: 白血病细胞经过 4T 高强静磁场照射 1h、8、24 h,谷 胱甘肽的表达水平较对照组明显降低 ,这提示高强静磁场可以降低白血病细胞内谷胱甘肽水平,对细胞产生氧化损伤作用. 损伤的机制可能为: 自由基是生物体内独立存在的含有未配对电子的顺磁性物质,因此会受到磁场的吸引,导致自由基参与的生理及病理活动受到影响[7].研究发现 ,60mT 的 静磁场照射人外周血白细胞 45 min,可使细胞内活性氧自由基升高[8].也有研究发现 12T 超强静磁场每天照射小鼠 2 h,连续 7 d,可以显着增强小鼠肝脏和肾脏中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活力. 作者认为由于体内超氧化物歧化酶,CAT 等抗氧化酶的活性中心都是一些磁性金属,它们具有顺磁性,在磁场中会受到磁力或磁力矩的作用,使得生物高分子的磁距取向发生改变,导致这些活性中心为磁性金属的酶的活性发生变化[9]. 本研究中实验组白血病细胞经过不同时间磁场照射,随时间延长,谷胱甘肽含量均数逐渐下降,但各组间无统计学差异,尚不能证明有量效关系,有待于增加实验样本数量进一步验证.

　　[参考文献]

　　[1] 薛飞,张宏伟,张莉,等.还原型谷胱甘肽对大鼠肝脏缺血再灌注损伤后炎性细胞因子表达的影响[J].中华消化外科杂志,2010,9(4):309-311.

　　[2] 王树叶,曹风林,曲洪澜,等.急性早幼粒细胞白血病 mdr1、GSTπ 表达与耐药的关系[J].临床血液病杂志,2009,22(9):469-472.

　　[3] 林秀梅,谢兆霞,秦 群.甲基莲心碱 、红霉素对 K562/A02 细 胞内谷胱甘肽含量的影响[J].中南大学学报(医学版),2004,29(3):284-286.

　　[4] 胡丽芳, 骞爱荣, 杨 鹏飞,等.中等强度静磁场对白血病细胞增殖和细胞周期的影响[J].第四军医大学学报,2009,30(5):397-400.

　　[5] Sullivan K,Blin AK,Allen RG.Effect of static magnetic fields on growth ofvarious types of human cell[J]. Bioelectromagnetics,2011,32(2):140-147.

　　[6] 宋 国丽 ,苏 海静,张 小云.不 同强度的静磁场对 K562 细 胞的作用 [J].2009,24(3):204-207.

　　[7] 关微华,马波,朱翔.恒磁场对人鼠血液流变学及一氧化氮含量的影响[J].中国医学物理学杂志,2003,20(2):122-123.

　　[8] Poniedziaek B, Rzymski P, Karczewski J,et al. Reactive oxygen species(ROS) production In human peripheral blood neutrophils exposed in vitroto static magnetic field[J]. Electromagn Biol Med,2013 ,32(4):560-568.

　　[9] 付 梅.生 物磁现象和磁效应及其应用 [J]. 现 代物理知识 ,2004,16(1):15-16.