核酸适体筛选技术最新研究情况综述

　　1990 年，Ellington 等[1]和 Tuerk 等[2]创建了一种能制备高特异性、高亲和力结合靶分子的寡核苷酸技术，称为指数富集的配体系统进化（systematicevolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技术。用这种技术制备的寡核苷酸分子称为适体（aptamer），一般由几十个核苷酸组成，可以是 RNA或单链 DNA.理论上几乎所有自然界中存在的靶分子均可通过 SELEX 技术筛选得到相应的适体。20多年来，核酸适体作为新型的仿生识别元素，在疾病诊断治疗、药物筛选、分子识别、分析检测等众多领域得到了广泛的应用，国内外众多科学工作者通过SELEX 技术筛选得到了多种靶分子的适体，核酸适体筛选技术本身也得到了不断地完善和发展。

　　1 SELEX 技术的原理及流程
　　
　　SELEX 技术是体外筛选核酸适体的基本方法，是一种以组合化学技术、PCR 技术以及基因克隆测序技术等为基础的现代分子进化工程技术，该技术的操作流程类似于达尔文的生物进化论中所包含的3 个过程：自发突变、自然选择和大量增殖[3].采用SELEX 技术筛选适体包括以下几个基本步骤：①人工合成随机的寡核苷酸序列文库，文库的容量一般在 1014~ 1018之间，文库中随机寡核苷酸序列一般为20 ~ 60 个碱基文库；②在特定的筛选缓冲体系中将寡核苷酸库与靶分子孵育；③用离心法、柱层析法、膜过滤法、毛细管电泳法、磁珠法等特定的方法，将与靶分子结合的寡核苷酸序列从体系中分离；④对分离的特异性结合的核酸序列进行 PCR 扩增；⑤将PCR 扩增获得双链 DNA 利用磁珠法、核酸外切酶法、变性高效液相色谱法拆分获得次级的寡核苷酸库；⑥重复② ~ ⑤步，随着筛选轮数的不断增加，文库里亲和力低的寡核苷酸序列被逐渐淘汰，对最终筛选到的寡核苷酸序列进行克隆测序，并对寡核苷酸序列与相应的靶分子结合的特异性和亲和力进行鉴定和检测[4].

　　2 核酸适体的筛选方法
　　
　　将分子进化的过程在体外进行是 SELEX 技术最大的特点，但在适体筛选的实际过程中，往往会受到筛选环境以及 SELEX 技术本身的限制，影响到筛选效率和效果。近年来，在传统 SELEX 技术的基础上，新的 SELEX 技术不断涌现，这些新的技术在不断完善 SELEX 技术的同时，也极大地推动了适体技术在生物医学、药物筛选、靶向治疗、农药检测[5]、环境监测、食品安全等领域中的发展和应用。

　　2. 1 毛细 管电泳 SELEX（capillary electrophoresisSELEX,CE-SELEX）技术
　　
　　如何将与靶分子结合的寡核苷酸从体系中分离出来，是限制传统 SELEX技术发展的一个瓶颈。2004 年，Mendonsa 等[6]根据核酸适体与靶分子结合后使靶分子原有的质量和构象发生改变并导致其电泳行为变化的特性，运用毛细管电泳技术将靶分子结合的核酸与游离的核酸进行了有效的分离。2005 年，Drabovich 等[7]利用CE-SELEX 技术，仅用 3 轮筛选就获得了能特异性结合 Muts 蛋白的适体。Tang 等[8]对毛细管电泳法与亲和层析法筛选蓖麻毒素的适体的结果进行比较，亲和层析法在第 9 轮筛选后结合率仅为 38. 5%,而毛细管电泳法在第 2 轮筛选后结合率已达 60. 2%,经过 4 轮筛选后结合率高达 87. 2%,整个实验在 2周之内完成。CE-SELEX 技术最大的优点就是显着提高了筛选效率，一般仅需 2 ~ 4 轮筛选即可获得所需适体[4].利用毛细管电泳的微量流体技术使得筛选效率大大提高，尤其适用于常规筛选不易获得的极少量靶物质的适体[9].徐华等[10]以表达有绿色荧光蛋白的 HepG2 细胞作为靶细胞，利用 CE-SELEX技术仅经过 1 轮筛选就获得了较好的效果。Krylov等[11]将动力学方法与毛细管电泳结合，创建了平衡混合物非平衡毛细管电泳（non-equilibrium capillaryelectrophoresis of equilibrium mixtures,NECEEM）技术。Berezovski 等[12]利用 NECEEM 技术，仅用了 1轮筛选就获得了亲和力为 1 nmol / L 的法呢基转移酶（farnesyltransferase,FTase）适体。Yang 等[13]利用CE-SELEX 技术，仅用了 3 轮筛选就获得了 NMM（N-methyl mesoporphyrin）的适体。Tran 等[14]利用这种方法，经过 8 轮筛选成功获得了花生过敏原之一的阿糖胞苷 H1 的适体。CE-SELEX 技术的主要缺陷是进样体积小（nL 级），文库中 DNA 分子的数量一般只有 1013个[4].

　　2. 2 荧光磁珠 SELEX（FluMag SELEX）技术
　　
　　2005年，Stoltenburg 等[15]引入荧光标记和磁珠分离技术筛选了链霉亲和素的适体，建立了 FluMag SELEX技术。他们首先将链酶亲和素包被在磁珠上，然后与文库孵育，将未与靶分子结合的核酸分离除去，对洗脱下来的目标核酸用荧光标记的引物进行 PCR 扩增，最后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收正义链生成次级文库进入下一轮筛选。同年，Mann 等[16]

　　利用该方法成功筛选到了乙醇胺的核酸适体。2010 年，Kim 等[17]用 FluMag SELEX 技术成功筛选到了布洛芬的适体，结果表明，所得适体对于布洛芬具有较高的特异性，而对于结构相似的布洛芬类似物（非诺洛芬、氟比洛芬和萘普生）和土霉素则未表现出任何的亲和力。2012 年，Xu 等[18]

　　用同样的方法筛选到了3,3′，4,4′-四氯联苯（PCB77）的适体，成为环境快速监测的潜在工具。该方法操作简单，筛选快速高效，所需靶分子量少，且节约成本，利用荧光来定量从而避免了同位素的使用，可以对与靶分子结合的核酸量进行定量监控分析。

　　2. 3 自动化 SELEX（automated SELEX）技术
　　
　　1998年，Cox 等[19]在 Beckmann Biomek 2000 Pipetting 系统的基础上创建了自动化筛选工作站，首先通过链酶亲和素与生物素之间的作用，将被生物素标记的靶分子固定在磁珠上；然后将与靶分子结合的寡核苷酸序列从体系中分离出来，RT-PCR 扩增和转录则通过已设定的程序自动完成；经 12 轮筛选成功获得了溶菌酶的适体，整个筛选过程仅用了不到 2 d 的时间。2005 年，Eulberg 等[20]在此基础上创建了半自动化筛选平台，并成功筛选出了 P 物质的适体。该筛选平台将超滤设备、荧光检测器和半定量 PCR 仪等设备整合到一起，实现了对与靶分子结合的寡核苷酸量的在线监控，同时也能满足在不同的缓冲溶液以及其他严格的筛选要求。2006 年，Hybarger等[21]创建了由 PCR 仪与 Labview 控制的活动瓣膜组成的微流 SELEX 样机，将操作转移到芯片微流环境中进行，具有提高筛选速度和降低成本等优势。

　　2. 4 细胞-SELEX（cell-SELEX） 技术
　　
　　cell-SELEX技术是指使用完整的细胞与核酸文库直接作用，从而筛选出能与细胞表面分子特异性结合的适体的技术。目前，采用该技术筛选到的一些适体已被用于疾病诊断和实验性的临床治疗中。Ara 等[22]采用cell-SELEX 技术成功筛选到了肿瘤细胞表面抗原的适体，从而避免了对抗原的纯化过程，同时保持了细胞表面抗原的天然构象，这对于肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。张兴梅等[23]

　　利用人工合成的 KLH-C18 作为靶标，用微孔板法进行 SELEX 筛选，完成了 7 轮筛选后，对最终筛选到的寡核苷酸序列进行克隆测序，选取适体 C6 进行结合 ELISA 的测定，并与转染 prominin-1 质粒的 U87 细胞免疫组化，用链酶亲和素磁珠进行适体 C6 的免疫共沉淀，经过 7 轮筛选得到了具有特定二级结构的适体，适体 C6 能与C18 肽和表达人 prominin-1 的 U87 细胞结合，pulldown 试验结果显示，C6 能识别天然状态下的 pro-minin-1 蛋白，为肿瘤的诊断与治疗奠定了基础。郭鹏等[24]运用 cell-SELEX 技术，经过 12 轮筛选最终获得了亲和性高、特异性强的胃腺癌早期原代细胞的适体，为胃腺癌的早期诊断和药物靶向治疗奠定了基础。2011 年，Li 等[25]用该方法经过 11 轮筛选，获得了大肠埃希菌 K88 的适体，该适体有望成为大肠埃希菌快速检测的潜在工具；次年，Liu 等[26]用同样的方法经过 11 轮筛选，成功获得了沙门氏菌 O8的适体。2013 年，Duan 等[27]利用 cell-SELEX 技术经过 8 轮筛选，获得了李斯特菌的适体，成为快速筛查和检测食源性疾病的潜在工具。Graham 等[28]则利用 cell-SELEX 技术筛选到了宫颈癌细胞的适体，可用作确定宫颈癌新的生物标志物。Ji 等[29]通过刺激-反应两步法的细胞 SELEX（stimulus-response cell-SELEX,SRC-SELEX）技术成功筛选到了动脉粥样硬化斑块组织发炎的内皮细胞的适体，该方法简化了cell-SELEX 技术繁琐和耗时的步骤。Chen 等[30]

　　利用活细胞表面 SELEX（cell surface SELEX,CS-SELEX）技术，经过 13 轮筛选，成功获得了能与丙型肝炎病毒包膜表面糖蛋白 E2 特异性结合的适体，为肝炎的早期诊断与治疗提供了新的思路。

　　2. 5 消减SELEX（subtractiveSELEX）技术
　　
　　subtractiveSELEX 技术的基本原理就是在筛选的过程中将能与已知或未知的共有靶分子结合的寡核苷酸从文库里去除，再将消减之后的次级文库投入到筛选的过程中。消减目的是进一步提高适体的特异性，减弱靶分子类似物的干扰，利用 subtractive SELEX 技术能从高度同源的靶分子中筛选到差异靶分子的适体，从而使得该技术在临床诊断和靶向治疗以及肿瘤的个性化治疗方面具有独特优势。陈桦等[31]以小鼠 IgG 亚类作为靶分子，采用靶标替换消减 SELEX的方法进行了 16 轮筛选，获得了能与小鼠 IgG 不同亚类相同部位 Fc 片段特异性结合的适体，为小鼠抗体亲和层析以及不同分子的相同部位的作用机制的研究奠定了基础。汪江波等[32]以 EP 管为筛选介质，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA）为正筛靶标，甲氧西林敏感葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus au-reus,MSSA）为反筛靶标，经过 20 轮筛选，成功筛选到了 MRSA 的适体，其中 AM6 能特异性结合 MRSA,这为以 AM6 作为靶向剂的新型的 MRSA 诊断与靶向治疗药物的开发奠定了基础。2012 年，Lee 等[33]通过 subtractive SELEX 技术，经 6 轮筛选获得了大肠埃希菌 O157:H7 的适体。2013 年，Wang 等[34]利用 subtractive SELEX 技术，经 9 轮筛选获得了高致龋变形链球菌菌株的适体。

　　2. 6 加尾 SELEX（tailored SELEX）技术
　　
　　人工合成的寡核苷酸序列通常包含中间的随机区和两端的固定区，虽然固定区方便了 PCR 扩增和体外转录，但往往会参与适体与靶分子的结合，从而对后续的截短活性序列造成影响，固定区还可能由于参与随机区的退火而影响筛选[4].2003 年，Vater 等[35]创建了tailored SELEX 技术，利用该技术成功筛选出了能高亲和力结合降钙素基因相关肽 1（calcitonin gene-re-lated peptide 1,Ca-CGRP1）的适体。他们在随机文库两端增加了较短的固定序列，以此与接头序列形成搭桥，PCR 扩增时引物与筛选库通过搭桥连接，扩增后引物被裂解，下一轮循环的寡核苷酸仍含有较短的固定序列。tailored SELEX 技术的两个额外步骤是引入连接接头片段和裂解 PCR 产物。用该技术筛选获得的适体不含两端引物结合部位，无需进行截短处理便可得到只含随机区的适体，从而解决了常规SELEX 技术筛选后续截短处理所带来的问题。

　　2. 7 结合定量 PCR 的 SELEX 技术
　　
　　该方法将适体的特异性与定量 PCR 的放大性相结合，从而有助于筛选到高亲和力的适体，同时也大大提高了对靶物质的检测水平[9].Avci-Adali 等[36]将定量 PCR 技术运用到 cell-SELEX 技术中，成功筛选到了高亲和力的适体。Liang 等[37]用该方法筛选到了抗狂犬病毒感染的活细胞的适体，有望成为治疗狂犬病的潜在工具。由于定量 PCR 技术具有高度的灵敏性，为了保证特异性，严格控制 PCR 的条件、充分洗涤、严格对照等是必要的。

　　2. 8 结合流式细胞的 SELEX 技术
　　
　　筛选过程中对核酸文库进行荧光标记与细胞作用，用流式技术完成分离后，再进行次一级的 PCR 扩增筛选，从而提高了对适体的筛选速率。陈文学等[38]

　　以人类疱疹病毒第四型（Epstein-Barr virus,EB）阳性低分化的鼻咽癌细胞为正筛靶标，正常鼻咽上皮细胞为反筛靶标，采用流式细胞仪检测核酸文库的特异性和亲和力，经过 10 轮筛选，文库与靶细胞的结合力随着筛选轮数的增加而加强，初步建立了 EB 病毒阳性鼻咽癌细胞适体文库，为鼻咽癌的诊断和治疗奠定了基础。

　　此外，还有切换 SELEX[39]、表达盒 SELEX[40]、无引物基因组 SELEX[41]、复合靶解析 SELEX[42]、非SELEX[43]、变构 SELEX[44]、磁珠 SELEX[45-47]、捕获SELEX[48 ]、微孔板 SELEX[23 ]、RNA 适体隔离 SE-LEX[49]技术等。

　　3 展 望
　　
　　SELEX 技术自出现以来，就得到了不断的丰富与完善，核酸适体的应用范围也越来越广，尤其在生物医学、药物筛选和靶向治疗等研究领域，具有极大的应用价值。对于一些小分子物质很难得到相应的抗体，而适体的获得相对容易，因此，适体技术也可用于农药检测、环境监测、食品安全等领域。目前SELEX 技术的发展非常迅速，但要筛选到可供现实使用的适体依然面临一些困难，适体的特异性仍存在问题。如何快速筛选出特异性高、亲和性强的适体，仍是科研工作者们未来的研究方向。