运用高效液相色谱法测定血液中4种抗癫痫药的浓度

　　PB、PHT 和 CBZ 是传统的一线抗癫痫治疗药物 , 由于这 3 种抗癫痫药物的有效血药浓度范围较窄 , 患者之间个体差异较大 , 抗癫痫作用和毒性与在体内的血药浓度有很大的相关性 , 需要进行血药浓度的监测和个体化给药。LTG 是一种苯三嗪类的新型广谱抗癫痫药 , 由于该药与目前常用的抗癫痫药如 PHT、CBZ 等在药动学上存在相互作用 , 导致个体间血药浓度差异较大 , 临床使用时也需要进行血药浓度的监测和个体化给药。

　　高效液相色谱法同时测定血清中 LTG、PB、PHT 和CBZ 浓度国内已有报道。文献［1-3］中使用的流动相依次为甲醇 - 乙腈 -0.1% 三氟乙酸水溶液 (20∶13.5∶66.5)、乙腈 -磷酸盐缓冲液 (30∶70)、甲醇 - 磷酸盐缓冲液 (56∶44, V/V,pH5.5), 所用流动相多含有无机盐或酸 , 在实际临床应用中操作繁琐 , 不利于日常工作的开展。本实验室采用甲醇 - 水(55∶45) 为流动相 , 建立了更为简单、方便的高效液相色谱法 ,同时测定上述 4 种药物的血药浓度 , 适用于医疗机构开展常见抗癫痫药物的血药浓度监测。

　　1仪器与试药

　　1. 1仪器 戴安 P680 高效液相色谱仪 , AUW120D 电子天平 ( 日本岛津 ), WH-866 旋涡混合器 , TGL-16A(B) 高速离心机。

　　1. 2试药 LTG 对照品 ( 中国食品药品检定研究院 , 批号 ：100775-200401) ；PB( 中国食品药品检定研究院 , 批号 ：1222-9602) ；PHT( 中国食品药品检定研究院 , 批号 ：100210-201002) ；CBZ( 中国食品药品检定研究院 , 批号 ：100142-201105) ；甲醇为色谱纯 ；水为重蒸水。

　　1. 3统计学方法 采用 DAS2.0 药物代谢动力学软件对数据进行回归分析。

　　2方法与结果

　　2. 1色谱条件 色谱柱 ：Waters Symmetry C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ；流动相 ：甲醇 - 水 (55∶45) ；流速 ：1.0 ml/min ；检测波长 ：235 nm ；柱温 ：35 °C ；进样量 ：20 μl。

　　2. 2专属性考察 取空白血清 200 μl, 按“2.4”项下方法处理 , 进样分析 , 记录色谱图 , 结果表明血清中内源性物质对样品的测定无干扰。见图 1。

　　2. 3溶液的制备

　　2. 3. 1对照品贮备液的制备 分别准确称取 LTG、PB、PHT 和 CBZ 对照品适量 , 用甲醇溶解并定容 , 制备成 LTG、PB、PHT 和 CBZ 浓度分别为 500、1000、700、350 μg/ml 的对照品贮备液 , 置于 -30℃ 冰箱中贮存。

　　2. 3. 2标准血样的制备 分别精密量取对照品贮备液适量 ,用甲醇稀释成为适当浓度的系列混合工作液。取此工作液 ,加入适量空白人血清 , 制成含 LTG 1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/ml；含 PB 3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg/ml；含 PHT2.19、4.38、8.75、17.50、35.00、70.00μg/ml；含 CBZ 1.09、2.19、4.38、8.75、17.50、35.00 μg/ml 的 系 列混合标准血样。

　　2. 3. 3质控血清的制备 分别精密量取对照品贮备液适量 ,用甲醇稀释成为低、中、高对照品混合溶液。取此对照品混合溶液 , 加入适量空白人血清 , 制成含 LTG 3.13、12.50、25.00 μg/ml ；含 PB 6.25、25.00、50.00 μg/ml ；含 PHT 4.38、17.50、35.00 μg/ml；含 CBZ 2.19、8.75、17.5 μg/ml 的低、中、高质控血清。

　　2. 4血清样本处理 取血清样品 200 μl, 加入甲醇溶液 600 μl,涡旋30 s, 15000 r/min离心5 min, 取上清20 μl直接进样分析。

　　2. 5线性关系考察 取系列混合标准血样各 200 μl, 按“2.4”项下方法处理 , 取上清 20 μl 进样分析 , 以峰面积 Y对浓度X作线性回归 , 得回归方程与线性关系 , 结果表明 , 各药物的峰面积与浓度均呈良好的线性关系。见表 1。

　　2. 6精密度试验 取低、中、高三个浓度质控血清 , 按“2.4”项下方法处理 , 取上清 20 μl 进样分析 , 每个样本连续进样 3次 , 计算精密度 , 结果表明仪器精密度良好。见表 2。

　　2. 7回收率试验 取低、中、高三个浓度质控血清 , 按“2.4”项下方法处理 , 每个浓度平行制备 3 份 , 取上清 20 μl 进样分析 , 计算方法回收率 , 结果表明方法回收率良好。见表 2。

　　3讨论

　　文献［1-3］中均采用内标法 , 内标液用甲醇等易挥发有机溶液配成 , 不宜长期反复使用 , 且操作较烦琐 , 不适于临床常规监测。外标法进样量要求十分准确 , 本试验所用的戴安 P680 高效液相色谱仪配有自动进样器 , 避免了手动进样的误差。结果表明 , 仪器精密度高、样品预处理方法操作简便、快速 , 可在短时间内处理大量样品 , 适用于临床血药浓度的监测［4］。

　　色谱条件的选择尤其是流动相的组成直接影响到日常工作的开展。文献［1-3］中使用的流动相均含有无机盐或酸 ,平衡流动相和冲洗色谱柱时间较长 , 干扰因素多 , 不利于色谱柱的保护 , 在实际临床应用中操作繁琐 , 不利于日常工作的开展。本实验室采用甲醇 - 水 (55∶45) 为流动相 , 上述 4种抗癫痫药物得到了较好的分离 , 各药物峰形良好 , 优化了流动相组成 , 为准确、快速测定上述 4 种抗癫痫药的血药浓度提供可靠的手段 , 可为该类药物的血药浓度监测、个体化给药方案的制定、药物滥用监测以及药物代谢动力学研究等方面提供帮助。

　　LTG、PB、PHT 和 CBZ 的有效血药浓度分别为 3~15、15~40、10~20、4~12 μg/ml, 本实验中上述 4 种药物的线性范围分 别 是 1.56~50.00、3.13~100.00、2.19~70.00、1.09~35.00 μg/ml,所得线性范围涵盖了上述药物的治疗窗 , 可满足临床治疗药物监测要求。

　　参 考 文 献

　　［1］ 杨洁 , 焦正 , 施孝金 . 高效液相色谱法同时测定人血浆中 6 种抗癫痫药物及两种活性代谢物的浓度 . 中国药学杂志 , 2006,41(24):1899-1902.

　　［2］ 刘颖 , 王丽 , 何大可 . RP-HPLC 法同时测定卡马西平、拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英钠及环氧卡马西平的血清浓度 . 中国临床药理学与治疗学 , 2005, 10(8):846-851.

　　［3］ 刘亦伟 , 王长连 , 黄品芳 . 高效液相色谱法同时测定拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英、卡马西平的血药浓度 . 中国医院药学杂志 ,2012, 32(23):1660-1662.

　　［4］ 刘海涛 , 唐跃年 . HPLC 法测定癫痫患儿血浆中拉莫三嗪的浓度 . 中国药房 , 2011, 22 (2):128-129.