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诱导多潜能干细胞转化为神经前体细胞的实验分析(2)

来源:学术堂 作者:朱老师
发布于:2016-11-17 共5631字
  2. NPCs的诱导
  
  使用经EBs多步法将i PSCs诱导成NPCs( 中国科学院动物研究所)。图2是连续培养传代中的NPCs,细胞以椭圆形为主,胞核大,胞体较圆,突起不发达,免疫荧光染色Nestin阳性( 图4 ~ 6) ,其中有极个别的β-Tub-Ⅲ阳性细胞( 图7 ~ 9)。
  
  3. NPCs的分化
  
  在分化培养基内培养7d的NPCs与在NPCs培养基内培养的细胞相比,细胞呈长梭形,多角形,细胞突起细长发达( 图3) ,免疫荧光染色β-Tub-Ⅲ阳性细胞数增多,每个高倍视野3 ~ 5个( 图10 ~ 12)。
  
  讨 论
  
  1.神经干细胞的判定
  
  神经干细胞能够自我更新,分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[14].本实验发现,利用经EBs,N2B27作为选择培养基,多步法贴壁培养诱导的NPCs,在体外可以不断地增殖传代,神经干细胞的标记Nestin阳性,极个别的细胞表达早期分化神经细胞的标记β-Tub-Ⅲ,经适当处理后,β-Tub-Ⅲ阳性细 胞 增 多。由 于NPCs培 养 基 成 分 复 杂,Neurobasal、B-27Supplement内的成分同样复杂,所以 很 难 解 释 去 除Neurobasal、B-27Supplement后β-Tub-Ⅲ阳性细胞增多的原因。目前的实验数据,该方法诱导的NPCs有神经前体细胞的特征,但还达不到NSCs的标准。
  
  2.神经前体细胞的分化
  
  关于NPCs的分化,根据文献[15,16],当去掉生长因子后NPCs向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。但我们先后在原有NPCs培养基的基础上分别去除b FGF、EGF或同时去 除b FGF、EGF,或在去除b FGF、EGF的基础上添加血清等,于培养3 ~ 5d后均出现NPCs死亡的现象。有研究表明,只用b FGF诱导随着传代次数的增加,细胞向胶质细胞分化[17]; 而EGF在NPCs诱导过程中至少发挥两个作用: 首先,与单独使用b FGF相比,EGF有赋予细胞形成神经的能力,不会使细胞随着传代次数的增加向胶质分化; 其次,EGF通过抑制凋亡维持细胞的自我更新,故本实验联合使用b FGF与EGF.有实验表明,在EGF缺失的情况下层黏连蛋白(laminin,LN) 可以维持细胞存活; 但去除EGF后,在LN上单独使用b FGF不能维持细胞增殖,这可以部分解释本实验去除EGF后,单独使用b FGF细胞死亡的原因。Okabe等[15]在诱导ESCs分化为NPCs的研究中使用m N3FL培养基对NPCs进行扩增,由于LN比纤维连接蛋白(fibronectin,FN) 对细胞的增殖有更高的刺激,所以m N3FL培养基内添加了LN和b FGF,去掉b FGF后NPCs向神经元和胶质细胞分化。而本实验在去掉b FGF后,细胞的死亡可能与缺少LN有关,这也提示单独EGF可能不足以维持细胞存活。如果单独1种因子不足以维持细胞存活,当两种因子去除后没有任何因子,细胞难以存活就更可以理解了。虽然更换分化培养基后β-Tub-Ⅲ阳性细胞增多,但就目前的资料,尚无法解释本方法诱导的NPCs没有分化的原因。
  
  3.拟胚体的培养
  
  EBs是ESCs在体外悬浮培养,生长增殖聚集,形成的具有三维特征的球状体( 或称之为多细胞聚集物) ,由于这种球状体与其被植入体内后所形成的胚胎组织十分相似,故将其称之为拟胚体或类胚体。在这些聚集物内,不同种类细胞之间的复杂相互作用,可以诱导干细胞向3个胚层分化。拟胚体通常由具有3个胚层特性的衍生物所组成,可以认为是大多数成熟体细胞系的前体细胞。EBs的重新接种将导致进一步的分化和生长。
  
  与ESCs相类似,体外i PSCs未分化状态的维持,依靠细胞因子,比如白血病抑制因子(leukemiainhibitory factor,LIF) ,与gp130受体结合产生的作用。一旦这种自我更新的刺激去除后,i PSCs很快失去未分化的表型开始分化。EBs的形成就是抑制因子去除后i PSCs分化的结果。
  
  最早通过EBs诱导NPCs的实验是在不同的时间窗用维甲酸(retinoic acid,RA) 处理EBs,然后接种到不同介质的表面,接种后细胞出现神经元的形态,表达神经元特异的基因。诱导EBs形成的培养基是DMEM( 高糖,含有谷氨酰胺,没有丙酮酸) 添加10%的胎牛血清(FBS) 和10%的新生牛血清,但是没有LIF,没有β-巯基乙醇[18].
  
  Wernig等[16]诱导i PSCs形成EBs,使用的培养基是DMEM含有10%的FBS、谷氨酰胺、非必需氨基酸、Hepes、β-巯基乙醇、青-链霉素。我们使用的是N2B27培养基。该培养基的成分很复杂,但共同点是都不含有LIF,这是保证i PSCs分化为EBs的先决条件。我们的培养基内不含有血清,可见血清不是EBs形成的必要条件。由此可见EBs的形成对培养基成分的要求不严格,在上述的各种培养基内,都能形成EBs.如果N2B27培养基不是后续实验的先决条件的话,我们可以考虑换一种简单廉价的培养基进行诱导。
  
  4. NPCs诱导培养基的选择
  
  本实验诱导EBs成为NPCs使用的是无血清选择培养基N2B27培养基,Okabe等[15]相同的实验使用的是ITSFn培养基,其成分是在DMEM/F12(1∶ 1)的基础上补充了胰岛素(5mg /L)、转铁蛋白(50mg /L)、硒酸钠(30 nmol / L) 和FN(5mg / L)。Oki等[19]使用的是DMEM/F12,2mmol/L L-谷氨酸,1. 6g /L葡萄糖,和N2supplement.N2supplement的成分有转铁 蛋 白 (10g /L)、胰 岛 素 (500mg /L)、孕 酮(0. 63mg/L)、腐胺(1. 611g/L)、亚硒酸盐(0. 52mg/L)。由此可见,虽然各个实验室所用的方法不同,但转铁蛋白、胰岛素、硒酸钠是它们共有的成分。转铁蛋白对细胞存活有普遍效应,胰岛素对Nestin阳性的细胞存活更特异[15].如果最终目的一致,第3种方案相对更简单。
  
  本实验仅对i PSCs向NPCs的分化进行了初步地探讨,使用经EBs,以N2B27作为选择培养基,多步法贴壁培养可将i PSCs诱导为有一定神经特征的前体细胞。
  
  参 考 文 献
  
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