干细胞中长链非编码RNA的研究综述

　　随着人类基因组计划的不断推进，人们发现 90%以上的基因组 DNA 能转录成 RNA,而其中不足 2%编码蛋白质[1-2],其余不能编码蛋白质的转录产物被称为非编码 RNA（ non-coding RNAs,ncRNAs）[3].根据长度不同，ncRNAs 可以分为短链 ncRNAs 和 长 链 ncRNAs （ long ncRNAs,LncRNAs） .

　　LncRNAs 缺乏特异完整的开放阅读框，几乎不具有蛋白编码功能。近年来有研究报道 LncRNA 参与干细胞多种生物学特性的调控[4].现将对 LncRNAs 在干细胞中的研究进展予以综述，重点剖析 LncRNAs 与干细胞自我更新和多向分化之间的关联。

　　1 LncRNAs 的概念。

　　LncRNAs 是一类长度通常大于 200 个核苷酸，缺少特异完整的开放阅读框，不具有或几乎不具有蛋白质编码功能的RNA,在总 ncRNAs 中占有相当大的比例。LncRNA 起初被认为是基因组转录的“噪音”,因其数量、种类、功能状况均不明确，且尚缺乏有效的研究手段，故又被称作基因组中的“暗物质”[5].尽管这些 RNA 不能编码蛋白质，却能在基因表达的多个环节（ 包括表观遗传、转录调控以及转录后调控等） 发挥调控作用。

　　2 LncRNAs 的结构、分类和功能。

　　LncRNAs 与 mRNA 相似，经过剪切，具有多聚腺苷酸（ polyA ） 尾 和 启 动 子 结 构。LncRNAs 具有较低的进化保守性，其在细胞中的表达水平也明显低于编码蛋白的 RNAs.大约2 /3 的 LncRNAs 来源于基因之间的广大基因组区域，其余的则来源于与编码蛋白的基因重叠、反义或基因内区域。根据与编码蛋白基因的位置关系，LncRNAs 大致分为正义（ sense） 、反义（ anti-sense） 、双向（ bidirectional） 、基因内（ intronic） 和基因间（ intergenic）5 种类型[6].通过在不同组织和细胞中进行高通量的 RNA 测序实验发现 LncRNAs 的表达还具有明显的组织和细胞特异性[7-13].近年来大量研究表明，LncRNAs 与 许 多 细 胞 学 功 能 有 着 密 切 的 联 系[14-17].如LncRNA 可以作为短链 ncRNAs 的前体，形成微 RNA 以及内源小干扰 RNA,还可以作为微 RNA“分子海绵”,对有活性的微 RNA 产生长效的抑制作用[15]; 在细胞亚结构以及蛋白复合物的形成过程中 LncRNA 发挥“脚手架”的作用[16],可以将两个或两个以上的蛋白分子“绑和”形成复合物。简言之，LncRNAs 可以通过与 ncRNAs,mRNA,基因组 DNA 以及多种蛋白质相互作用在转录、转录后、翻译水平以及表观遗传等多个层面影响细胞的生命活动。

　　3 LncRNAs 与干细胞。

　　干细胞是一类能够自我更新并具有多向分化潜能的细胞。在一定条件下，它们能够分化成多种成熟的功能细胞。近年来关于 LncRNAs 在干细胞中的研究层出不穷。

　　3. 1 LncRNA 与胚胎干细胞 （ embryonic stem cells,ESCs）ESCs 通常是由早期胚胎内细胞团（ 如桑葚胚，囊胚） 或原始生殖细胞经体外分化抑制培养筛选出的一类多能干细胞，在体外具有无限增殖、自我更新和多向分化的能力。最近研究已经证实 LncRNAs 在维持人类 ESCs 自我更新能力和多能性方面具有重要作用[17].

　　Guttman 等[14]最先对基因间的长链 ncRNAs（ large inter-genic non-coding RNA,LincRNAs） 在 ESCs 中的表达和功能做了一系列研究，RNA 测序结果显示有 226 条 LincRNAs 在鼠ESCs 中显着高表达。他们发现绝大多数的 LincRNA （ 约93% ） 对 ESCs 中的基因表达有明显的调控作用，有 26 条LincRNAs 能够显着影响多能性调控因子 Nanog 的表达水平，表明 LincRNAs 在维持干细胞多能性以及抑制细胞分化中起到重要作用。他们还发现，有13 条 LincRNAs 与 ESCs 内胚层的分化有关，7 条与外胚层的分化有关，5 条与神经外胚层分化相关，7 条与中胚层的分化相关，2 条与滋养外胚层的分化相关。这说明 LincRNA 在 ESCs 的种系特异性分化中发挥重要的调控作用。随后他们还研究了 ESCs 中的 LincRNA 是否受到多能性相关转录因子（ Oct4,Sox2,Nanog,cMyc,nMyc,KLF4,ZFX,Smad and TCF30 ） 的调控。结果发现有 75% 的LincRNA 的启动子区域能与至少一条多能性转录因子相结合，说明这些 LincRNAs 是多能性相关转录因子的作用靶点。此外还发现有 74 条（ 30%） 的 LincRNAs 与 ESCs 中重要的染色质修饰蛋白密切相关。

　　Dinger 等[18]在鼠 ESCs 中发现了 12 条 LncRNAs 与转录因子 Pou5f1、Nanog、Sox2 的表达谱相似，这些转录因子在维持ESCs 多能性状态中具有重要作用。随后运用染色质免疫沉淀（ ChIP） 以及抗-Pou5f1 和抗-Nanog 抗体进一步证实了这些LncRNAs 确实与 Pou5f1 和 Nanog 相结合[19].

　　Ng 等[20]也发现了 36 条 LncRNAs 的表达谱与 Oct4 和Nanog 相似，而 Oct4 和 Nanog 在 ESCs 中普遍高表达且在分化成熟的细胞中表达降低。LncRNAs 表达谱芯片结果显示，在人类 ESCs 和神经前体细胞中有 934 条 LncRNAs 的表达有明显差异，其中有 36 条 LncRNAs 在神经前体细胞中显着下调。

　　随后他们挑选了 3 条 LncRNAs（ ES1,ES2,ES3） 做进一步的功能性研究，发现这 3 条 LncRNA 中任意一条被沉默以后，均会促使 ESCs 分化。RNA 免疫沉淀实验发现，在细胞核内 ES1和 ES2 与多梳基因家族成员 SUZ12 以及多能性调控因子SOX2 密切相关。

　　Sheik Mohamed 等[21]通过免疫沉淀反应，找到了一组与Oct4 和 Nanog 结合的 LncRNAs,并对这些 RNAs 做了后续的测序实验，随后干扰了这些 LncRNAs 的表达并观察了 ESCs分化活动的变化，结果提示，有部分与 Oct4 和 Nanog 结合的LncRNAs 具有调控 Oct4 和 Nanog 的作用。这些研究表明，ESCs 的多能性以及种系特异性分化受到LncRNA 作用网络的严密调控，而这些 LncRNAs 中又有很大一部分受到 ESCs 内众多转录因子的调控。