应用血液核酸检测技术扩增技术室内质控方法探索

　　应用血液核酸 检测技术 （nucleic acid test,NAT）对HBV、HCV和HIV感染者进行检测，其“窗口期”较抗体检测窗口期大大缩短，且能检出病毒抗体或抗原阴性的慢性携带者及变异株病毒的感染者，在许多发达国家和地区已普遍应用于献血者血液筛查.目前，随着 《血站技术操作规程（2012版）》的颁布，我国采供血机构血液筛查核酸检测技术正在逐步推广。核酸检测技术中的室内质量控制是保证日常检测结果可靠性的重要环节，本实验室前一阶段使用基于转录介导的扩增法（transcription-mediated amplication,TMA）技 术的诺华PROCLEIX TIGRIS系统 ,进行血液筛查标本的检测，由于目前尚未见TMA扩增技术室内质控方法的相关报道，所以对使用外部标准物质进行基于TMA技术的核酸检测过程的室内质控方法和意义进行探索，现将有关情况报道如下。

　　材料与方法

　　1材料

　　1.1主要仪器与试剂：PROCLEIX TIGRIS系统、PROCLEIX ULTRIO联检检测试剂盒（美国诺华生物诊断公司），批号603009、609833,操作严格按照仪器、试剂说明书和本实验室SOP进行。

　　1.2外部阳性标准物质

　　1.2.1外部标准物质的选择：参照ELISA试验中尽可能选定室内质控品浓度接近检出限的原则，HBV DNA含量至少为检出限的5倍，HIV RNA和HCV RNA含量至少为检出限的3~4倍[2].试剂说明书提供数据显示HBV DNA项目95%检出限为10.4IU/ml,HCVRNA项目95%检出限为3.0IU/ml,HIV RNA项目95%检出限为45IU/ml,同时考虑影响外部标准物质运输途中的冷链保证、长时间保存、不同核酸的降解速度和易降解程度等因素后，选择HBV DNA外部标准物质浓度为50IU/ml、HCV RNA外部标准物质浓度为50IU/ml、HIV RNA外部标准物质浓度为200IU/ml.

　　1.2.2外部标准物质来源、批号及浓度：购自康彻斯坦生物，标准物质浓度选择及批号为：HBVDNA浓度50IU/ml,批号201201001、201304001;HCV RNA浓 度50IU/ml,批 号201112002、201304001;HCV RNA浓 度200IU/ml,批 号201203001、201304001.

　　1.3 PROCLEIX ULTRIO质控品及校准品

　　1.4室内质控数据来源：2012年10月~2013年6月血液核酸筛查的室内质控外部阳性标准物质检测数据，包括HBV DNA、HCV RNA以及HIVRNA阳性标准物质检测数据。

　　2方法

　　2.1外部阳性标准物质每日随当日血液筛查标本一同进行核酸单人份联检，每日检测一套3个项目的外部标准物质。

　　2.2汇总检测数据，剔除离群值后，计算每个项目阳性标准物质检测值的均值、标准差和变异系数。

　　2.3数据统计：箱体图法使用。SPSS17.0软件包，计算数据上四分位数（Q3），下四分位数（Q1）和四分位距（IQR）,IQR=Q3-Q1;绘制箱体图判定离群值或通过计算判定离群值：当检测值X>Q3+1.5×IQR或X<Q1-1.5×IQR时判定为离群。峰度法[3]根据公式，计算bk后查界值表，找出离群值。

　　结果

　　1箱体图法结果HBV DNA项目根据PRO-CLEIX ULTRIO说明书提供的试剂HBV DNA95%检出限为10.4IU/ml,室内质控外部标准物质浓度为50IU/ml,结果显示在185次检测中有2次 检测值为离群值，剔除离群值后检测 均值为14.07,CV为7.04%.HCV RNA项目根据PRO-CLEIX ULTRIO说明书提供的试剂HCV RNA95%检出限为3.0IU/ml,室内质控外部标准物质浓度为50IU/ml,结果显示在185次检测中有8次检测值为离群值，剔除离群值后检测均值为7.78,CV为7.58%.HIV RNA项目根据PRO-CLEIX ULTRIO说明书提供的试剂HIV RNA95%检出限为45IU/ml,室内质控外部标准物质浓度为200IU/ml,结果显示在185次检测中有3次检测值为离群值，剔除离群值后检测均值为16.46,CV为8.14%,结果见表1.

　　3个项目外部标准物质检测值上、下四分位数见表2,HBV DNA外部标准物质检测值X>16.815或X<11.215即为离群，HCV RNA外部标准物质检测值X>9.36或X<6.28即为离群，HIV RNA外部标准物质检测值X>20.05或X<12.925即为离群。3个项目各次实验检测的外部标准物质检测值箱体图见表1和图1~3.

　　2峰度法结果HBV DNA项目185个质控值计算bk=18.64>b（1-α）（α=0.05），提示存在离群值，剔除最远的值23.13后，对剩下的质控值进行峰度检验，bk=2.88<b（1-α）（α=0.05），提示未发现离群值；HCV RNA项目185个质控值计算bk=30.12>b（1-α）（α=0.05），提示存在离群值，剔除最远的值21.91后，对剩下的质控值进行峰度检验，bk仍>b（1-α）（α=0.05），提示仍然存在离群值，继续剔除，剔除后再次进行峰度检验，直至将离群值21.91、21.68、21.56、20.69、20.06、14.3全部剔除后，再次对剩下的质控值进行峰度检验时bk=2.75<b（1-α）（α=0.05），提示未发现离群值。

　　HIV RNA项目185个质控值计算bk=3.14>b（1-α）（α=0.05），提示存在离群值，剔除最远的值20.49后，对剩下的质控值进行峰度检验，bk仍>b（1-α）（α=0.05），提示仍然存在离群值，继续剔除，剔除后再次进行峰度检验，直至将离群值20.49、12.46、20.1全部剔除后，再次对剩下的质控值进行峰度检验时bk=2.97<b（1-α）（α=0.05），提示未发现离群值。

　　讨论我国血站血液检测大部分采用ELISA方法，采用2种不同试剂平行检测2次，由于方法学的固有缺陷，检测“窗口期”长，风险相对较高[4].根据国内外相关文献报道[5-8],应用NAT法检测血液标本 可以进 一步缩短检测窗口 期，阻断部分因ELISA检测“窗口期”漏检而导致的输血传染病发生，从而降低输血传播性疾病风险，提高血液安全。

　　但是目前国内血液核酸检测技术还处于起步阶段，对于核酸检测的室内质量控制的具体应用仍不完善，而核酸检测的室内质量控制又是确保检测结果正确性、可靠性的重要步骤。因此，做好室内质量控制对今后核酸检测工作的推广具有重要意义。

　　诺华PROCLEIX TIGRIS系统、PROCLEIXULTRIO联检检测试剂盒具有完善的内部质控系统，包括内对照（IC）、校准品C0-C3、内部质控品T0-T3.内对照存在于各检测反应管包括校准品、内部质控品反应管，内对照检测结果均须高于内对照阈值反应管检测结果才能判定为有效，内对照可以监控整个实验过程，防止由于反应过程中外部因素干扰造成核酸降解而导致的假阴性发生。校准品C0-C3用于确定当批次实验的Cut off值，防止因试剂差异而导致的假阴性或假阳性的发生。内部质控品T0-T3用于判定当批次实验结果是否有效，仅根据内部质控品T0-T3结果是否为预期阴性或阳性进行判定。诺华检测系统的内部质控体系可以全面覆盖检测的整个过程，但是仅可以作为当批次实验有效性的验证，并不能发现仪器整个使用周期的趋势性变化。我们实验室使用外部标准物质共进行185次检测，在185次外部标准物质的检测中，三个项目使用箱体图法和峰度法进行分析后分别出现13次和10次检测值离群，而无论箱体图法还是峰度法，发现外部标准物质检测值离群时，诺华的内部质控系统均未表现出异常，可以看出诺华内部质控系统不能帮助实验室根据检测结果的趋势性变化制定下一步的工作计划。因此，除诺华的内部质控系统外，需在检测体系中引入外部标准物质进行室内质控。

　　诺华检测系统是基于TMA技术进行血液核酸检测，该技术根据待测物相对光强度单位与Cutoff值的比值来判定实验结果，其测定值是反映最终扩增产物所产生的相对光强度，且TMA技术在扩增过程中呈现的是爆发性增长，所以其测定值与初始浓度并无线性相关，不适宜采用Levey-Jennings质控图进行室内质控定量分析。同一批号的外部标准物质待测标志物含量相对恒定，在诺华系统内的反应过程也一致，推断同一批号外部标准物质的最终测定值应该相近；在工作中我们使用外部标准物质的测定值绘制箱体图，也可以发现测定值均落在一定范围内。当出现离群值时，若可排除外部标准物质发生变化而导致的检测值异常，可考虑分析检测过程是否发生变化或实验人员操作过程中出现失误。

　　TMA法适宜采用阴性反应、阳性反应作为室内质控是否失控的定性指标，检测值的离群分析作为辅助指标，以便进行检测系统的趋势性分析，更好地监测核酸实验过程是否发生变化，结果是否可靠。

　　在选择离群值检验方法时，箱体图法简便明了，但在分析三个项目时，较国标GB/T4883-2008中推荐使用的峰度法共多出3次离群值情况，检验效能可能比峰度法差，质控值容易发生假离群的情况。峰度法为国标推荐，检验效能高，但公式复杂，不易操作。所以我们在日常工作中可以使用比较简便的箱体图法进行质控值分析，在回顾性分析总结时使用峰度法进行分析。两种方法搭配使用，既能便于工作的顺利进行，在阶段性分析时又能保证分析结果的准确可靠。

　　引入外部标准物质进行室内质控，除根据检测结果的阴性、阳性来判定当批次实验的有效性，增强当批次实验结果的可靠性外，还可以根据检测结果的离群值进行分析，推断实验过程是否发生微小变化，建立更为完善的质量控制体系。对于实验室质量体系的建立与提高具有重要的意义。

　　参考文献：
　　1任芙蓉.血液病毒核酸筛查的研究进展[J].中国输血杂志，2008,21（11）:890-892.
　　2吴亚玲，祝宏，董杰，等.血液核酸筛查室内质控品浓度选择的探讨[J].中国输血志，2013,26（2）:170-171.
　　3 GB/T 4883-2008.数据的统计处理和解释正态样本离群值的判断和处理.