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针刺及艾灸对M3受体mRNA表达的调节作用

来源:未知 作者:傻傻地鱼
发布于:2014-09-02 共2372字
论文摘要

  我们通过药物乌头碱诱发家兔心律失常,利用 RT-PCR 法检测不同组别的家兔心脏 M3受体mRNA 的 表达变化 , 探讨针刺及艾灸对 M3受体mRNA 表达的调节作用, 为针刺和艾灸治疗心律失常提供实验依据。

  1、 材料与方法

  1.1 实验动物 新西兰家兔,雄性,3~4 月龄,体质量 2~3 kg,清洁级,上海生旺实验动物养殖有限公司提供,合格证号:SCXK(沪)2007-0007。

  1.2 主要试剂 乌头碱(中国药品生物制品检验所,批号:110720-200410);乌来糖(国药集团化学试剂有限公司,批号:20060323);总 RNA 提取试剂盒、RT 试剂盒(美国 Invitrogen 试剂公司);引物由上海生工生物工程有限公司合成; PCR 试剂盒(中国 Tiangen 公司)。

  1.3 主 要仪器 PTC -200 PCR 仪 ( 美 国 ABI 公司);RM6240B 多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂);AllegraTM64R 低 温 高速离心机 ( 美国Beckman 公司);DYY-III2 水平电泳仪 (北京六一仪器厂);DU530 紫外分光光度计 (美国 Beckman公司);ZF-90 紫外透射仪 (上海顾村电光仪器厂);GENE GENIUS 生物成像系统 (美国 Syngene公司);BCM-1000 超净工作台 (苏州净化设备有限公司)。

  1.4 方法

  1.4.1 动物分组 新西兰家兔 40 只,随机分为对照组、药物组、针刺内关穴组、艾炙组 4 组,每组10 只 。 每 组家兔腹腔注射乌来糖 1.1 g / kg 麻 醉后,用标准肢体Ⅱ导联连接,连续记录心电。 药物组:耳缘静脉注射乌头碱 25 μg/kg;对照组:耳缘静脉注射等容量的生理盐水;针刺内关穴组:耳缘静脉注射乌头碱 25 μg/kg 后,电针内关穴,电针 20 min,频率 3 Hz,变频 10 Hz,强度以家兔能够耐受,保持安静,不引起挣扎为度;艾灸组:耳缘静脉注射乌头碱 25 μg/kg 后,在内关穴用特制固定器点燃艾条, 在所取范围往返温和熏灸, 艾条与穴位距离以家兔能耐受为度,艾灸时间 20 min。

  1.4.2 心 肌组织 M3受体 mRNA 表达的检测 4组家兔 24 h 后处死, 迅速取下左心室, 剪成 1cm×1 cm。 用总 RNA 提取试剂盒提取总 RNA,利用琼脂糖甲醛变性凝胶电泳分析其质量, 并用紫外分光光度计测定其纯度和含量。 取 3 μg 总RNA 进行逆转录反应, 取 3 μL 逆转录反应产物进行 PCR 反应。 引物:M3上游引物:5’-GGTGT-GATGATTGGTCTGGC -3’, 下 游 引 物 :5’ -TTC-CAACTGTCACTGCTGCT-3’,扩增片段为 458 bp。

  同时设置 β-actin 为内参,上游引物:5’- CTCAT-GAAGATCCTCACCGA-3’,下游引物 :5’-ATCTC-CTTCTGCATCCTGTC -3’, 扩 增 片 段 为 387 bp。PCR 反应条件为: 预变性 94℃ 3 min, 94℃ 45 s,58℃ 45 s,72℃ 1 min, 循环 30 次后,72℃末端延伸 10 min。 PCR 产物上样于 1.2% 的琼脂糖凝胶进行电泳,UV 照相和密度扫描。

  1.5 统计学处理 数据用 x±s 表示,用 SPSS 15.0统计学软件进行处理, 不同组间的数据用单因素方差分析和 LSD 检验,P<0.05 为差异具有统计学意义。

  2、 结 果

  2.1 模型制备 模型组耳缘静脉注射乌头碱 25μg / kg,观察心电图的变化,记录心律失常的发生情况。

  2.2 电针干预对家兔心肌 M3受体 mRNA 表达的影响 表 1。 结果显示,与正常对照组比较, 药物组 M3受体的 mRNA 表达明显增加,针刺内关穴后,M3受体的 mRNA 表达与药物组比较有明显降低,P<0.05。

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  2.3 艾灸干预对家兔心肌 M3受体 mRNA 表达的影响  表 2。 结果显示,与正常对照组比较, 药物组 M3受体的 mRNA 表达明显增加,P<0.05。 艾灸组与药物组比较,M3受体的 mRNA表达有明显降低 P<0.05, 但较针刺内关穴组,M3受体的 mRNA 表达有所升高,差异不显著。
 

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  3、 讨 论

  3.1 心律失常的病因复杂,可由多种因素引起心肌电生理的异常。 乌头碱能直接兴奋心肌, 激活Na+通道,促进 Na+内流,对 L 型 Ca2+通道也有明显的通透作用,加速细胞膜的去极化,提高心房传导组织和房室束-浦肯野系统等快反应细胞的自律性,这是乌头碱致心律失常的主要机制。 心脏在交感神经和副交感神经的精细控制下完成正常的生理功能,心脏迷走神经通过刺激 M 型乙酰胆碱受体,调节心脏收缩力、兴奋性和传导。 近些年发现,M3受体不仅具有负性肌力和负性频率的作用,还可以介导一种新的钾电流,并且在充血性心力衰竭、 缺血性心律失常等疾病的发生发展中发挥着重要作用。 目前,越来越多的证据表明,心脏M3受体是一种新型的抗心律失常药物靶点。 研究表明 M3受体在病理状态下和生理状态下的功能性表达是不同的。 Shi H 等分别在充血性心力衰竭犬的心房肌细胞和健康犬的心房肌细胞上,通过 Western blotting 比较 M3受体的密度,全细胞膜片钳技术比较 M3受体激动的延迟整流钾电流(IKM3)的电流密度,发现 M3受体密度和 IKM3的电流密度在充血性心力衰竭犬的心房肌细胞上明显增加。 由此可见,心肌 M3受体在病理状态下,功能性表达明显增加。 宋娟等研究也发现乌头碱诱发心律失常后, 大鼠心肌 M3受体 mRNA 的表达增强。 本实验通过乌头碱诱发新西兰家兔心律失常后, 通过半定量 RT-PCR 法检测 心脏 M3受体mRNA 的表达变化,结果也发现心肌 M3受体 mR-NA 的表达增强。

  3.2 内关穴是手厥阴心包经的络穴,又是八脉交会穴,通阴维脉;心包经和手少阳三焦经相表里,故针刺内关可以通三焦,调诸脏。 心居上焦,亦受其调节。 所以,针刺或艾灸内关穴对心律失常有调整作用。 与临床常用的抗心律失常药相比,针刺和艾灸具有使用安全、费用低廉、副作用小的优点。

  本实验结果表明针刺内关穴组的 M3受体 mRNA表达较药物组低,艾灸组的 M3受体 mRNA 表达也较药物组低, 证实了针刺或艾灸内关穴可以在一定的程度上降低 M3受体的表达,提示针刺或艾灸内关穴治疗心律失常与 M3受体的参与有关。

  参考文献:
  [1] 王 丽娟 ,吕爱红. 救 治急性乌头碱中毒探讨及体会 [J]. 医 药论坛杂志,2011,32(23):141-142.
  [2] 栾 海蓉 , 李海林 , 何志鹏 , 等 . M3受体激动剂胆碱对大鼠心肌细胞内钙离子的影响[J]. 医学综述,2012,18(15):2496-2498.

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