提取高质量卡特兰DNA的方法研究

　　摘 要

　　卡特兰花色艳丽，大方高雅，具有很高的观赏价值，被誉为“洋兰之王”，为世界人们喜爱。本试验建立了一套提取高质量的卡特兰 DNA 的方法，为卡特兰种质保存、鉴定和评价奠定了基础，也为卡特兰基因文库构建、分子辅助育种和基因克隆重组、功能鉴定等分子生物学实验提供了技术支持。

　　本研究以卡特兰着名品种漂亮女孩‘考娃’为材料，对卡特兰优化方法做了系统研究，具体研究内容如下：

　　1 通过对 CTAB 法，SDS 法和试剂盒法 3 种方法提取出的卡特兰 DNA 质量和含量进行对比，发现其差异显着。3 种方法提取 DNA 含量差异显着，由高到低依次为 CTAB法，SDS 法和试剂盒法。提取的 DNA 纯度由高到低依次为试剂盒法，CTAB 法，SDS法。3 种方法中试剂盒法提取卡特兰 DNA 含有杂质最少，DNA 含量也最少，CTAB 法提取的 DNA 质量优于 SDS 方法，提取 DNA 的含量最大。加上 CTAB 法所用试剂价格远低于试剂盒方法，所以选择 CTAB 法进行方法改良。

　　2.从去除多酚、去除多糖和盐类等小离子杂质、去除蛋白质、去除 RNA 四个方面对提取方法进行改良，优化 DNA，主要有以下发现：（1）去除多酚试验中发现加入 β-巯基乙醇能够防止卡特兰组织在水浴过程中褐化，而且未加入 β-巯基乙醇组的样品提取出来DNA 含量平均值为 327.5±22.45ng/?l，而加入 β-巯基乙醇组的样品提取出来 DNA 含量平均值为 489.8±20.11ng/?l，表明加入 β-巯基乙醇能够明显提高 DNA 的提取量。（2）在去除盐类糖类等杂质小离子试验中，发现在实验初始阶段加入 PVP 并且用用无水乙醇沉淀的实验组提取的 DNA 效果最好，OD260/230 在 1.98 至 2.13 之间，含量平均值为 427.2±18.75 ng/?l，用 NaCl 溶液和无水乙醇沉淀 DNA 的实验组提取 DNA 效果最差，OD260/230 都在 1.14 以下，含量最高仅为 124.7 ng/?l。（3）在去除蛋白试验中，用氯仿异戊醇抽提一次得到的 DNA 胶孔处有亮带，说明 DNA 蛋白质污染严重，进行两次抽提后胶孔处明显变干净，抽提三次后 DNA 紫外吸光值 OD260/280 都大于 2.0，说明多次抽提对于 DNA 蛋白质的去除作用明显。（4）在去除 RNA 时发现，加入不同浓度的 Rnase，对 DNA 含量和质量的影响不同，在 200?l 的 DNA 溶液中加入 0.5?lRnase 去除 RNA 效果最好，但是蛋白含量很高，需要继续进行蛋白质的去除得到合格的 DNA。将以上发现结合建立了优化 DNA 的方法。

　　3.以不同叶龄的卡特兰叶片为材料，用改良后的方法对其进行 DNA 提取，对比电泳图和紫外吸收值表分析发现提取 DNA 的含量从高到低依次为嫩叶，中叶，老叶，DNA质量嫩叶和中叶相近，OD260/OD230 最小为 1.98，其中嫩叶全部大于 2.0，老叶提取 DNA效果最差， OD260/OD230 均小于 1.25，表明杂质严重。

　　4.用改良后的方法提取卡特兰其他 4 个品种‘绿晶灵’，‘杨铭金童’，‘大牛’，‘seto’的 DNA，实验结果表明 4 个品种的 DNA 电泳条带清晰，紫外吸光值符合纯净 DNA 的要求，只是在 DNA 含量上有所差异。说明此方法对卡特兰有一定的适用性。

　　本实验得到的提取卡特兰 DNA 的方法能够提取优质卡特兰 DNA，可以为后续卡特兰杂种鉴定等分子实验提供技术支持。

　　关键词：卡特兰，DNA，提取，优化　　目 录
　　
　　摘 要
　　
　　第一章 绪论
　　
　　1.1 引言
　　1.2 国内外对卡特兰的研究现状
　　1.2.1 卡特兰植物概述
　　1.2.2 卡特兰观赏特性及应用
　　1.2.3 卡特兰研究进展
　　1.3 DNA 的研究进展
　　1.3.1 DNA 的提取的原理
　　1.3.2 DNA 提取方法
　　1.3.3 DNA 的纯化
　　1.3.4 DNA 检测与分析
　　1.3.5 DNA 的保存
　　1.4 研究目标和主要研究内容
　　1.4.1 研究目标
　　1.4.2 研究内容
　　1.5 研究技术路线
　　
　　第二章 DNA 的提取
　　
　　2.1 试验材料与研究方法
　　2.1.1 试验材料与试剂及器材
　　2.1.2 试验方法
　　2.2 试验结果与分析
　　2.2.1 试验结果
　　2.2.2 试验分析
　　2.3 小结
　　
　　第三章 DNA 的优化
　　
　　3.1 试验材料与方法
　　3.1.1 试验材料和药品
　　3.1.2 试验方法
　　3.2 优化结果与分析
　　3.2.1 多酚类物质的去除
　　3.2.2 多糖和盐离子的去除
　　3.2.3 蛋白的去除
　　3.2.4 RNA 的去除
　　3.3 小结
　　
　　第四章 不同叶龄的卡特兰叶片提取 DNA 的效果对比
　　
　　4.1 试验材料与方法
　　4.1.1 试验材料
　　4.1.2 试验方法
　　4.2 实验结果和分析
　　4.3 小结
　　
　　第五章 不同品种卡特兰提取效果的比较
　　
　　5.1 试验材料与方法
　　5.1.1 试验材料
　　5.1.2 试验方法
　　5.2 试验结果与分析
　　5.3 小结
　　
　　第六章 结论与讨论
　　
　　6.1 结论
　　6.2 讨论
　　6.3 展望
　　
　　参考文献