绵羊痘相关研究文献综述

　　第一章 文献综述

　　羊痘的研究进展

　　羊痘是由痘病毒科(Poxviridae）羊痘病毒（Capripoxvirus,CPV）感染山羊和绵羊等偶蹄动物引起的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]，临床上以发热、全身性痘疹和淋巴结病变为主要特征。羊痘是一种十分古老的疾病，1847 年英国已有绵羊痘爆发的报道，1958 年 Plowright 等首次分离到羊痘病毒[2],并确定了CPV 的分类地位。有本病的国家和地区的易感动物及其相关产品被世界各国列为严格限制进出口的对象，严重阻滞了国际贸易，因本病对养羊业的巨大影响，世界动物卫生组织（OIE）将其列为 A 类动物疫病（Cran 等，1993），法定通报传染病，且由于羊痘病毒可作为生物武器，有可能成为恐怖分子威胁世界和平的有力手段，被动植物审查机构 USDA 规定的 23 种可以作为生化武器的病毒之一[3]。我国将其列为一类动物疫病。目前，本病主要流行于非洲（中北部）、亚洲、欧洲以及澳大利亚等国家和地区，我国部分省份也有该病发生的报道，如江苏、贵州、内蒙古和青海等地。此外，本病对公共卫生也有所影响，中国、瑞典、印度等国家都有人类感染羊痘病毒并出现临床症状的报道[4]。

　　1 病原学

　　1.1 病毒的分类地位及形态特征
　　
　　山羊痘病毒属由绵羊痘病毒（Sheep pox virus, SPPV）、山羊痘病毒（Goat poxvirus, GTPV）和疙瘩皮肤病毒（Lumpy skin disease virus, LSDV）三种病毒组成[1]，它们同属痘病毒科（Poxviridae），是具有囊膜的双股 DNA 病毒中唯一在细胞浆内复制的病毒，山羊痘病毒属内三种不同病毒间呈血清学上的交叉反应[5]，但 LSDV 一般不感染山羊和绵羊。

　　羊痘病毒粒子呈卵圆球型，复合对称结构（Dales and pogo,1981）[6]，病毒体大小大约为 300×270×200nm，轴向比例为 1.2～1.7[7]。病毒感染细胞后可在感染细胞内形成胞浆包涵体，多呈椭圆形。病毒粒子具有一种由管状物组成的外层3结构，内部有哑铃样的芯髓，核心两面凹陷内各有一个侧体[5]。核酸由双股 DNA组成，拥有一个中心和少量的可变区域（大约为 145kb），分子质量为 130Ku×106～240Ku×106(Kitching and smale,1986)[8]。

　　1.2 病毒的理化性质及生物学特性
　　
　　1.2.1 羊痘病毒的理化性质

　　羊痘病毒是一种高度嗜上皮性的病毒，病毒粒子主要存在于病羊的粘膜、皮肤及痂皮内，此外，病毒也存在于病羊血液和鼻黏膜分泌物中。羊痘病毒繁殖的位置主要在细胞浆中，细胞内有大量以裸露形式存在的病毒，这一部分病毒被称为胞内裸病毒（Intracellular naked virus,INV），有少部分释放到胞外，成为胞外带衣壳病毒（Extracellu larenve-loped virus, EEV）[9]。羊痘病毒抵抗干燥的能力很强，可存活在干燥的羊舍内 6～8 个月，可存活在干燥的痂皮内 3～6 个月，能够承受反复冻融，冻干条件下可存活数个月。与大多数痘病毒相似，羊痘病毒耐热性较弱，置于 55℃ 20min 或 37℃ 24h 即能够使其丧失感染力，但不同羊痘病毒分离株对热的敏感性也不尽相同[10]，1979 年 Tantawi 等研究羊痘病毒的理化特性，发现在 56℃一个小时情况下，相对于伊朗和埃及的羊痘毒株，Dushmbe 株的抵抗力较弱[11]。该病毒对紫外线和日光均敏感，日光或紫外线直射可在不同程度上影响病毒的感染力。此外，该病毒对部分化学试剂也较为敏感，0.5%福尔马林、3%石碳酸、0.01%碘溶液和 3%盐酸都可在数分钟内使病毒失去感染力[12]，同时，有研究证实放线菌素-D 和溴脱氧尿苷均可抑制该病毒的 DNA 复制。

　　1.2.2 羊痘的生物学特性

　　绵羊痘病毒（SPPV）基因组约为 150kb，与其他痘病毒相同，绵羊痘病毒基因组为单分子的线状双股 DNA，其分子质量为 130×106～240×106ku[13]，包括中间编码区和两端相同的反向末端重复序列（Inverted terminal repeat, ITR），A+T含量约为 75%，含有 147 个开放阅读框（Open reading frame, ORF），编码密度约为 93%，能够编码 53～2027 个氨基酸不等[14]。羊痘病毒基因组中间的区域包含与其他痘病毒同源的保守序列，这一部分基因能够编码病毒复制所需的蛋白，并且负责包括病毒转录、RNA 修饰、病毒 DNA 的复制以及在胞内组装成熟，在胞外被蛋白膜包裹成成熟的病毒粒子等在内的任务[15]。两端基因序列（ORFs001～023 和 ORFs124～147），由一个基因家族（由 8 个基因组成）及其他与病毒修饰或逃避宿主免疫识别和反应相关的基因组成，其主要功能是负责编码白细胞介素-10（IL-10）、表皮生长因子样蛋白（EGF—like protein）、丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）、胞质分裂丝蛋白以及 PKR 阻遏蛋白等，除此之外，两端基因序列中还包括痘病毒特有的致病基因或选择宿主范围的基因[16]。病毒基因组末端基因区（ORFs001～23 和 ORFs124～147）包括 5 个锚蛋白重复基序（Ankyrin repeatmotif）和 3 个 Kelch-like 重复基序，这些基因区参与病毒修饰，逃避宿主的细胞凋亡以及免疫反应过程。Kelch-like 蛋白氨基端结构域（BTB/POZ 结构域）能够介导寡聚化，并参与蛋白与蛋白之间的相互作用，但此蛋白具体功能尚不清楚，但有研究表明，Kelch-like 蛋白氨基端结构域在疫苗病毒的细胞培养中是非必须的，有学者猜想它可能是介导病毒与宿主的特殊细胞组分之间的相互作用，因此该蛋白的改变可能与致弱病毒有紧密的联系。锚蛋白重复基序可能具有阻止病毒诱导细胞凋亡的功能，其特异性的补体很可能引起痘病毒宿主范围的改变。锚蛋白重复基序（Ankyrin repeat motif）和 Kelch-like 重复基序及其编码蛋白功能的揭示，将会为设计更有效的痘病毒疫苗提供新的思路。此外，羊痘病毒的几种基因可编码哺乳动物蛋白的同源物，如白细胞介素 IL-1β 受体、肿瘤坏死因子受体、干扰素 IFN-γ 受体及补体 C4结合蛋白，且都已在体外表达成功并检测了功能，它们与调整宿主对病毒感染的免疫反应有关，这些基因是一些非必须基因，很可能在早期启动子的控制下，感染宿主后不久就开始表达。这为研究病毒的感染、复制和与宿主细胞间的相互作用机制提供了新的视角[17]。

　　1.2.3 羊痘 P32 基因

　　在羊痘病毒的基因研究中，P32 基因是当前国内外研究最多的基因之一，P32位于基因组中部编码区，CPV 基因组的 64～65kb 处，由第 74 号 ORF 编码，编码 323 个氨基酸[18]，在山羊痘病毒属中 SPPV 和 GTPV 的 P32 基因的阅读框分别由 972、969bp 的碱基编码，323、322 个氨基酸组成，经学者对 P32 基因进行了同源性比较，其在基因组程度上高度保守，在氨基酸水平上有 94.7%的同源性，在核苷酸水平上有 97.5%的同源性[19]。绵羊痘与山羊痘病毒的 P32 基因最主要的区别在于，绵羊痘病毒序列中的第 55 位是天冬氨酸，而在 GTPV 及 LSDV 中此位置处均无此氨基酸。P32 基因编码的 P32 蛋白是当前分离鉴定得到的所有羊痘病毒毒株所共有的，该蛋白是羊痘病毒膜表面的一种主要的结构蛋白，具有很强的特异性，分子量为 32ku，包含中和表位，能够强烈的诱导细胞免疫[20]。将 P32蛋白抗原应用于 ELISA 方法中检测羊痘病毒，能够在很大程度上提高其灵敏度和特异性[21]。

　　1.3 病毒的分离培养

　　羊痘病毒在体外研究中可以在多种宿主细胞上生长，其中最多的是来自绵羊、山羊和牛的细胞。羔羊睾丸细胞以及绵羊和山羊的肾细胞对病毒高度敏感，感染后能够发生典型的细胞病变，如细胞变圆、皱缩、肿胀、细胞核变为空泡、染色质碎裂以及胞浆内出现包涵体[22]。绵羊甲状腺细胞，山羊胚胎细胞也可以用来分离羊痘病毒。此外，一些分离株还能够在牛胚胎肌肉细胞和牛肾细胞生长（Davies and Mbugwa,1985）[23]。该病毒也可在已建立的细胞系中生长，如 Vero细胞（S.S.Chaudhary and K.D.Pandey）[24]，MDBK 细胞（Joshi,1995）[25]，BHK细胞等。此外，绵羊痘病毒还可在鸡胚绒毛尿囊膜上生长（殷震,1997）[26]。

　　2 流行病学

　　2.1 流行现状及地理分布

　　羊痘是一种十分古老的疾病，其历史与天花同样久远，在公元 2 世纪的欧洲和亚洲就已有出现（Hutyra,1946）[27]，但直至 1847 年英国首次出现准确的关于绵羊痘病爆发的报道 ， 1958 年 Plowright 等首次分离到羊痘病毒（Capripoxvirus,CPV），其分类地位才得以确定。羊痘现已在全世界多个国家和地区广泛传播[28]，至今为止已有很多国家对羊痘进行了正式报道：如尼日利亚[29]、肯尼亚[30]、阿曼苏丹共和国[31]、埃及[32]、科特迪瓦[33]、坦桑尼亚[34]和埃塞俄比亚[35]等非洲国家；如南斯拉夫[36]、匈牙利[37]和意大利[38]等欧洲国家；如约旦[39]、孟加拉国[40]、印度[41]和中国等亚洲国家；澳大利亚[42]等大洋洲国家，其中以非洲北部及印度次大陆地区流行最为严重。在我国贵州（王开功等，2003）[43]、黑龙江（孙悦等，2003）[44]、河北（林敏等，2002）[45]、江西（王效田等，2001）[46]、福建（廖振续，1997）[47]和内蒙古（娜仁，2002）[48]等多个省市自治区均有关于羊痘发生的报道。根据 2013 年《中华人民共和国农业部兽医公报》公布的羊痘疫情信息，我国有 10 个省自治区在 2013 年度发生了羊痘疫情，其中包括：内蒙古、甘肃、宁夏、安徽、云南、青海、陕西、重庆、浙江、山东。根据 2013 年《中华人民共和国农业部兽医公报》每月发布的疫情信息，总结我国该年度羊痘发生的地域分布与各省、自治区发病数量，2013 年羊痘在我国西北和华中地区流行较为广泛，而在东北和华北等地区病例则较为少见。详细信息见图 1-1。

　　

　　2.2 流行特点

　　自然状态下，羊痘病毒能够感染所有年龄段，所有性别，所有品种的羊，但其中最常发病的和最为严重的是幼畜、老畜以及泌乳期的母畜[49]。该病毒主要的感染方式是病毒通过呼吸道进入宿主体内或直接接触感染动物和疑似感染动物，传播媒介主要为气溶胶，含有羊痘病毒的灰尘和皮屑均可成为造成病毒传播的载体[50]，病毒也能够以昆虫为媒介在破损的皮肤之间进行传播[51] [52]。病毒主要存在于病羊的痘疮、浆液及水泡皮内[53]，此外，病羊及处于潜伏期的羊的口和鼻泪分泌物、乳汁、尿液、血液以及精液也是病毒传播过程中病毒的重要来源[5]，被病羊污染的饲料、垫草、皮毛和饲养人员也都可成为传播载体。该病在全年的任何时间均可发生，但在冬季和干旱的季节多发，因为在这样的条件下，羊自身可释放能抑制机体免疫系统的应急因子，导致地方性流行或广泛流行[54]，霜冻、雨雪、寒冷的气候、饲养管理不良等因素都可成为该病的诱因，并且在一定程度上加重病情。

　　3 发病机理

　　羊痘病毒是一种高度嗜上皮性的病毒，皮肤、肺脏以及呼吸道和消化道黏膜是其主要的侵袭部位，病毒到达皮肤和黏膜等感染部位的主要方式是通过血液循环，到达感染部位，病毒主要在上皮细胞胞浆内繁殖，病毒繁殖伴随机体发生一系列的炎症反应，与此同时发生发热、特异性斑疹、丘疹等病理过程[55]。国内外研究者普遍认为，羊痘病毒可以在接种疫苗时逃避疫苗产生的抗体的中和作用，抗体在一定时间内并不能阻止病毒在感染细胞内的复制[56]，主要的原因是羊痘病毒只在细胞浆内增殖病毒，绝大部分的病毒以裸露的形式存在于细胞内，而羊痘感染途径是通过被病毒感染的巨噬细胞和血液中胞外衣壳病毒随血液到达皮肤和粘膜，故在部分时间内羊痘疫苗的抗体并不能够对病毒起到中和作用[57]。

　　4 临床症状

　　自然感染过程中，羊痘的潜伏期约为1～2周不等，潜伏期过后，患病动物开始出现体温升高、呼吸困难、精神沉郁、食欲匮乏、心跳加速、眼睑水肿、弓背、流涎、咳嗽、肺炎、过敏症、便秘、少尿等临床症状[58]，随后体温持续上升，最高时可达41～42℃，在此之后1～2天，病羊出现皮肤损害，最初局部皮肤出现红斑，1～2天后，逐渐变为丘疹突出于皮肤表面，随后丘疹逐渐增大，变为灰白色或淡红色的隆起结节，结节在几天之内转变成典型的水疱，水疱内容物起初为透明液体，而后变为脓性液体，形成脓疱，最后破溃结痂。出现皮肤损害的部位多是腹股沟、腋下和会阴等皮肤无毛或少毛部位，乳腺以及具有分泌消化液功能的粘膜和呼吸系统粘膜。在形成水疱这一过程中，特别是伴随持续高热时，由于病毒进入血液循环而引起的脓毒血症，通常能够引起羊的死亡[59]。随后，若无继发感染则局部病变逐渐干燥呈棕色痂块，此痂块脱落后留下红斑，随着病程的逐渐延长，红斑逐渐变淡，红斑将会持续3～4周，而后逐渐消失；但部分病例由于营养条件、感染器官、饲养条件等问题机体不能够完全恢复，出现其他病症继发感染，如布鲁氏菌等引起腱鞘炎、睾丸炎、流产、轻瘫等病症。羊痘发生后期，出现严重的呼吸困难、消瘦，最后多以衰竭死亡告终，但单纯感染羊痘病毒的死亡率并不高，通常在10%左右[60]。

　　5 病理变化

　　5.1 体表病变

　　病羊体表出现典型的痘疹、唇、舌、鼻镜、乳房、会阴和尾根等无毛少毛处可见大小不等的痘疹，严重时可见痘疹出现溃疡灶（王开功等，2003）[43]。

　　5.2 剖检变化

　　剖检可见气管充血，肺部出现扁豆大小，子弹型结节或半球形结节，与腺瘤很相似，切面均匀，质地坚硬，病灶周围有时可见充血和水肿[61]，肺表面经常发生巧克力色实变；咽、唇、气管、皱胃、心脏、肾、睾丸、舌头、硬腭和软腭食道以及肠等器官出现大小不等，形状各异的结节状痘疮[62]，其中一些痘疮的表面发生糜烂和溃疡，特别是唇粘膜与胃黏膜表面尤为明显；脾脏淋巴结红肿，出现白色坏死斑；胸部出现较多量的淡红色胸膜水[63]。

　　5.3 镜检变化

　　镜检感染羊痘的病羊时，典型的病变特征是出现羊痘细胞，羊痘细胞以细胞内出现嗜酸性包涵体和空泡样细胞核为主要特征[64]，线粒体肿胀变圆；高尔基复合体极度扩张，有时甚至破裂解；内质网扩张，小泡状增生；大量卵圆形的成熟病毒粒子广泛存在于胞浆内，有的细胞中可见典型的病毒包涵体形成[65]。羊痘病毒感染皮肤的表皮、皮下组织、附件、胶原蛋白、弹性蛋白和网硬蛋白；表皮的病变主要为皮肤棘刺化、角化不全或角化过度、多层上皮细胞肿胀变性、细胞内含物感染病毒后引起上皮细胞增生、内皮细胞增生以及微循环中出现囊泡；在真皮中，具有免疫功能的细胞如巨噬细胞、中性白细胞、淋巴细胞、浆细胞大量浸润，造成脉管炎并形成血栓和梗塞，以及部分区域的坏死和浮肿，造成副皮质区淋巴细胞数量减少；脾脏和淋巴细胞中的生发中心消失；毛囊与皮脂周围的细胞表现为变性、核固缩、核溶解；皮下组织镜检可见中性白细胞和巨噬细胞浸润[66][67]；感染病毒的肺组织可见充血，大量渗出物，出现大量巨噬细胞，细支气管淋巴样组织增生，肺泡浮肿，在出现有炎症反应的周围可发现凝固性坏死灶，肺小叶浓缩；第四胃的鳞状上皮细胞胞浆稀疏，水肿。

　　6 诊断
　　
　　6.1 临床诊断

　　首先进行流行病学调查，随后观察病羊的临床症状，根据得到基本信息对疾病进行初步判断，在此基础上，进行剖检，检查有无羊痘特征性病理变化，综合各方面信息进行诊断，为了进一步确诊，可以采取动物接种试验，方法为采集患部的丘疹或痘痂，将其制作成乳剂，采用皮内或静脉注射的方式，将其接种于未患过羊痘的健康羊1～2只，如若发生全身性痘疹或部分痘疹，即可确诊为羊痘[68]。

　　6.2 实验室诊断

　　6.2.1 琼脂糖凝胶实验（Agar Gel Precipitation Test ,AGPT）

　　Bechold 首次发现 AGPT 可用于检测病毒，但并没有应用到羊痘的检测，直至 1960 年，Bhambani 等首次通过使用同源血清凝胶扩散技术诊断羊痘，后又发现异源血清也可用于诊断羊痘[69]。随着可溶性抗原的发现，极大的提高了琼脂糖凝胶实验检测羊痘的效率，使用非感染性可溶性抗原来代替感染性抗原，结果发现与传统的 AGPT 相比较，不仅可以避免应用感染性抗原可能带来的安全问题[70]，同时可在较大程度上提高了羊痘的检出率，此外，使用 35S 蛋氨酸标记的抗体剂也可在一定程度上提高 AGPT 检测羊痘病毒抗体的敏感性。虽然不可溶性抗原的发现极大的提高了 AGPT 的检测效率，但该试验检测羊痘病毒的特异性基数较低，更为严重的是，因为羊痘病毒与传染性脓包性皮炎病毒抗体经常出现有交叉反应，经常出现许多假阳性结果[71]。

　　6.2.2 对流免疫电泳（Counter immune electrophoresis, CIEP）

　　对流免疫电泳现已普遍被用于检测多种抗原或抗体。对流免疫电泳比琼脂糖凝胶实验在诊断羊痘过程中更加快速敏感。CIEP 能够有针对性的检测各个不同器官，不同组织中羊痘病毒的感染情况(Chand P,1985)，相对于 AGPT 更加方便快速。CIEP 在检测接种疫苗抗原时比 AGPT 更加准确敏感[72]。此外 Rao 等发现使用生理盐水代替传统的巴比妥缓冲液可以提高 CIEPTest 的敏感性[73]。

　　6.2.3 乳胶凝集实验（Latex Agglutination Test, LAT）

　　在乳胶凝集试验中，胶乳株作为一种非常便捷的载体，使得包被抗原颗粒变得十分容易（Hudson and Hay,1989）[74]。通过乳胶凝集含量测定可以检测多种多样的抗原－抗体系统，不需要昂贵的仪器，而且相对更为快速，值得注意的是，乳胶凝集实验在一些羊痘样品检测中比 CIE 实验检测的具有更高的效率（Rao,1996）[75]。

　　6.2.4 血清中和试验（Serum Neutralization Test, SNT）

　　血清中和试验可用于检测大部分病毒，但并不能够检测羊痘病毒，主要的原因是只有部分病毒粒子发生中和反应引起的血清中和反应效率过低，并且中和反应已被证实不能够准确检测动物的免疫指标[76]。

　　6.2.5 荧光抗体技术（Fluorescent Antibody Technique, FAT）

　　荧光抗体技术是以荧光物标记抗体进行抗原定位的技术，可以对细菌、病毒和寄生虫进行检验，也可以进行自身免疫病的诊断，检测速度快，操作简单且敏感性高，作为一种十分重要的研究病毒的手段，现在已经被学者们广泛接受。在检测羊痘过程中，间接荧光抗体实验（IFAT）比直接免疫荧光更为敏感，由于其额外的可附加的结合位点的作用。荧光抗体现已经在羊痘研究的多个方面得到广泛应用，流行病学调查，检测羊痘病毒抗原，病理学研究以及研究在细胞培养病毒过程中抗原出现的时间和病毒的复制位点。此外，FAT 还可在感染羊痘病毒的水肿液，皮肤等患病部位检测出羊痘抗原。单克隆抗体（MAb）的出现也在一定程度上提高间接荧光抗体技术检测的敏感性和特异性[77]。

　　6.2.6 间接血凝实验（Indirect Hemagglutination Test, IHT）

　　间接血凝实验（IHT）是将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，将其制作成致敏的载体，然后使用相应的抗体（或抗原），从而使红细胞拉聚在一起，出现可见的凝集反应。羊痘病毒不能够直接引起血细胞凝集（Matthews,1982）[1]，但使用致敏的绵羊血红细胞可以有效的检测羊痘，比 AGPT 和 CIE 试验更为敏感，值得注意的是经过戊二醛和鞣酸处理过的血细胞在间接血凝抑制实验测定羊痘病毒时能够起到更好的效果（Rao and Negi,1997）[76]。除间接血凝抑制试验外，协同凝集反应（Joshi,1989）和被动血细胞凝集（Joshi,1991）都可对羊痘病毒进行检测[78]，1996 年 Tiwari 等通过将羊痘抗原连接到戊二醛致敏的绵羊红细胞上的方法，成功建立了检测羊痘的斑点凝集实验[79]，斑点凝集实验具有快速和简便等优点，十分适用于基层单位[71]。

　　6.2.7 单向辐射溶血试验（Single Radial Hemolysis test, SRH）

　　单向辐射溶血试验是抗原抗体复合物在免疫过程中应用血细胞中的补体溶解功能。使用SRH能够简单定量检测抗原抗体，1997年，Tiwari和Negi将羊痘病毒抗原/抗体连接到绵羊红细胞上，通过溶血实验来检验羊痘的抗体/抗原的方法建立了检测羊痘的单向辐射溶血实验[71]，结果证实，SRH是一种十分简便高效检测抗原、抗体以及接种后免疫应答情况的方法[80]。并与AGPT和CIEP比较灵敏度，事实证明SRH具有同等的敏感性。

　　6.2.8 酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)

　　ELISA 检测试验现已成为被广泛应用的检测抗原或抗体的血清学方法，与上述几种血清学检测方法相比较而言，由于 ELISA 较高的灵敏度，各种类型的ELISA 检测方法相继被建立应用于羊痘诊断[81]。然而 ELISA 方法在其检测快速高效的同时，也存在大量困难，如出现较多的背景反应，试剂要求的特殊性，这些问题成为了限制进行 ELISA 检测的主要障碍。正因如此，其他方式的 ELISA试验逐渐被研发出来[82]。研究表明，使用在大肠杆菌中表达的羊痘 P32 重组融合蛋白的间接 ELISA 方法检测羊痘十分快速、准确率高，没有其他感染影响，且与 VNT 相比这种方法能够在接种疫苗后更早的时间能内检测出抗体的存在。
　　
　　Carn VM 在 1995 年使用免疫捕获 ELISA 方法在羊痘结痂血液中检测单一含量的病毒，但单一含量测定有相当的局限性，结果相对模糊，若要进行进一步的精确诊断则需与 CIE 试验相互结合[83]。有研究表明点状 ELISA 也可用于羊痘病毒的检测，实验过程中使用硝酸纤维化皮质，将会更有利于病毒的检测，该试验在检测羊痘过程中的敏感度是单向辐射溶血实验的三倍。另外一种新型的蛋白生物素ELISA 也被研究用于检测羊痘病毒的检测。随后，可溶性抗原的发现可以在一定程度上降低背景反应对病毒检测的影响。随着实验用的重组蛋白逐渐易于获取，新型的检测试剂逐渐被开发出来[84]，ELISA 已成为有效检测羊痘病毒抗原抗体的重要方法，也可应用至免疫评价和流行病学研究中，且具较高的特异性和敏感度，但实际操作需要昂贵的仪器，熟练的技术以及相当的专业素养，适用于在实验室中进行检测，相对于广大基层兽医相关单位来说，并没有普遍应用的意义。

　　6.2.9 免疫印迹实验（Western blotting）

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体后（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸入蛋白质，在此过程中，能够保持通过电泳分离的多肽类型及生物学活性保持不变。有固相载体的蛋白或多肽作为抗原与对应的抗体发生免疫反应，随后，再与酶或同位素标记的第二抗体反应，通过特定的底物显色或放射显影以检测电泳分离得到的蛋白质成分。Western blotting印迹是以羊痘病毒感染的细胞溶解物来检查血清样品中病毒结构蛋白的特异性抗体，其敏感性及特异性均较高。但由于该实验花费昂贵且操作难度较大，不能够被广泛使用[85]。

　　6.2.10 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）

　　PCR 是 OIE 指定的检测羊痘病毒的方法。上述多种血清学检测方法如ELISA，AGPT 等多种方法都可用于检测羊痘病毒抗原抗体，但检测的敏感性始终较低。目前为止，高度敏感分子生物学技术依赖于 PCR[86]。自 1985 年首次研发出 PCR 后，PCR 技术逐渐应用到检测各种病毒的实验中，Ireland 等以 SPV 基因组的附着蛋白基因和融合蛋白基因序列设计的引物具有 SPV 特异性，可利用限制性内切酶识别位点对 PCR 产物的特异性进行证实[87]；Mangana.V.O 等建立了简单、快速、特异的检测羊痘的 PCR 方法，使用的引物是来自羊痘病毒 KS-1和Ins-1株的倒置末端重复序列，能够将SPPV与CPDV和疱疹病毒(Herpesviruses)区分开[88]；郭巍、陈杰等人初步建立了用于诊断山羊皮肤组织中的山羊痘病毒的PCR 方法，该方法采用 PCR 反应对羊痘病毒 P32 基因进行扩增，进而对皮肤组织样品中的痘病毒进行检测，但这种方法的弊端是需要大量的核酸，然而在病料处理以及核酸提取过程中可能造成核酸大量流失，严重影响实验结果的准确性[89]；Markoulatos.P 等用倒置末端重复序列和 α 微管蛋白为目的基因设计引物，成功建立了检测皮肤组织中的羊痘病毒的多重 PCR 技术，该技术采用 3 对引物、一步扩增方法，与单一引物的 PCR 方法相比具有更高的敏感性和特异性[90]。

　　颜新敏等根据羊痘病毒的 P32 基因和羊口疮病毒的 H2L 基因序列设计合成两对引物，成功建立了一种能够同时对羊痘病毒和羊口疮病毒进行检测的双重PCR 方法[91]；向智龙等针对山羊痘病毒的 ITR 基因和羊口疮病毒的 H2L 基因设计合成了 2 对特异性引物以进行羊痘和羊口疮的双重 PCR 检测。双重 PCR 方法可同时检测羊痘和羊口疮两种疾病，且敏感性及特异性均较高[92]。

　　荧光定量 PCR（Fluorescent quantivative）是 1996 年由美国 Aplien Biosystems公司开发的一种新定量试验技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，利用相应软件对产物进行分析，计算待测样品模版的初始度。这种方法比传统的 PCR 方法更为敏感。程振涛等建立了基于 TaqMan 探针的 FQ-PCR 检测羊痘的方法，该方法操作简单，单次样品检测时间不超过 2h，能够检测疮痂、皮肤病灶、口鼻拭子、血沉棕黄层、肺部及淋巴结中的羊痘病毒[93]。此后，有研究人员将传统 PCR 与 FQ-PCR 相比较发现两者均对能够特异性的检测羊痘病毒，但相比之下，FQ-PCR 的敏感性是传统 PCR 的 100 倍，对 DNA 的最低检测限为 0.042pg/反应。

　　随着 PCR 技术的不断发展，环介导等温扩增（LAMP）技术也逐渐被开发和应用到病毒检测当中。黄鹤等根据 GenBank 中羊痘病毒的保守基因序列，设计出针对羊痘病毒的 LAMP 引物，进行等温扩增，将结果证明病毒核酸的最低检测含量为 3.1×10-2pg/?L，灵敏度是 OIE 推荐的 PCR 方法的 104倍，成功建立了羊痘病毒环介导等温扩增(LAMP)的检测方法，在此基础上添加钙黄绿素（calcin）建立的目测法，还可实现对羊痘病毒检测结果肉眼观察。这种方法相对于荧光定量 PCR 具有操作简单、灵敏度高、特异性强，反应更快速、设备要求低等优点[94]。

　　7 疫苗
　　
　　临床上针对羊痘并无特效药，主要的预防控制措施是接种疫苗，根据已有报道证明，虽然多种疫苗均可用来预防羊痘，但其中减毒疫苗的效果最好。全球现有很多种 CPV 疫苗已被批准上市，如表（1-1）。

　　

　　7.1 灭活疫苗

　　亚洲、非洲等不同地区的不同毒株都有被制成灭活疫苗的报道，不同佐剂对疫苗效果的影响较大，其中以 AlCl3·6H2O 为佐剂的灭活疫苗效果较好。现在普遍认为羊痘灭活疫苗最多只能提供短暂的保护（Prasad and datt，1973；Yadav，1986），其原因主要是由于羊痘病毒抗原存在形式的特殊性。羊痘病毒有 2 种抗原存在形式：①短杆状成分包围的完整病毒粒子，一般见于经反复冻融的感染组织培养细胞；②寄主细胞膜包围的完整病毒粒子，常由感染动物产生。正因为这些特殊性，导致通过组织培养细胞制备的灭活疫苗全部为裸露的病毒粒子，作为疫苗接种后并不能够刺激机体对膜包围的病毒粒子产生免疫[62]，此外，由于灭活疫苗本身存在的缺点，不能够刺激机体产生强有力的细胞介导免疫反应，而痘病毒的主要免疫方式是细胞免疫。基于以上原因，灭活疫苗的效果一般不理想，与弱毒疫苗相比之下对羊痘的保护能力较弱。

　　7.2 弱毒疫苗

　　目前，弱毒疫苗是预防和控制羊痘的主要手段[95]。SPPV 分离株如阿尔及利亚、肯尼亚、罗马尼亚和蒙古等多株羊痘病毒经传代致弱后都被成功制成了活毒冻干疫苗，现在的弱毒疫苗使用的传代细胞是多种多样的，如羊睾丸细胞、牛肾细胞、胎羊的肾和肺以及皮肤组织细胞，其中肺组织培养的羊痘病毒更适合制成弱毒疫苗（Bhanuparkas V,2004）[96]。这些弱毒疫苗在全世界范围内被广泛使用，具有很高的免疫原性，且免疫力长久，如绵羊和山羊以肯尼亚 0240 疫苗株免疫后的保护力长达一年以上，有的甚至可终生免疫[23]。目前我国主要使用的疫苗是1958 年沈荣显等将分离到的羊痘病毒太原株经过鸡胚传代致弱而制成的弱毒活疫苗，其免疫期可达 1 年，目前为止，国外还没有羊痘病毒经过鸡胚培养出弱毒的报道。弱毒疫苗接种一年一次，接种时无论羊只大小，一律在尾内面或股内侧注射 0.5ml/只，接种后接种羊易成为传染媒介，故只可用于全群免疫[97]。母羊在接种同年产下的羔羊同样具有良好的免疫保护力。

　　SPPV 弱毒疫苗现已成为全世界广泛预防羊痘的主要方法，但在不同国家免疫保护程度不尽相同，减毒疫苗能够产生痘疮反应，甚至导致接种疫苗的动物死亡，并造成疾病扩散，同时有可能引起羊痘传播，因此羊痘弱毒疫苗的广泛应用也受到了一定的限制。

　　7.3 多肽菌苗

　　羊痘病毒的 VP3 蛋白现已被确认是羊痘主要的免疫蛋白，可诱导较高水平的体液和细胞免疫应答，有报道将 VP3 蛋白原被弗式不完全佐剂乳化后注入兔体内，可产生 1:256 滴度的血清中和抗体，免疫 21d 后，攻毒，数据显示，免疫保护率可达 67%，这种疫苗需要更深层次的研究方可达到预防的效果和广泛应用的目的[98]。

　　7.4 亚单位疫苗

　　1994 年，Carn 等将在大肠杆菌体内表达的 GST 融合重组 P32 蛋白（GST-P32）纯化后分别按 300?g、600?g 混合弗氏佐剂，以肌肉注射的方式进行接种，根据后期实验，对重组蛋白的保护性进行了研究[83]。实验结果证明这种疫苗接种实验羊 29 日后羊血清中的羊痘病毒中和抗体水平已经达到了羊痘阳性血清的水平。

　　以 300?gGST-P32 二次免疫后 35d 皮下接种强毒，两天后，虽然接种部位仍会出现皮肤损害，但皮肤损坏程度降低，其后溃烂等症状并没有严重蔓延。试验证明虽然亚单位疫苗不能有效预防羊痘病毒的感染，但可以提高病毒中和抗体水平，削弱羊痘发病的临床症状，能够影响病毒向周围扩散，并且增强动物对病毒反应的敏感性[99]。

　　7.5 基因重组疫苗

　　基因重组疫苗是通过 DNA 链的断裂和链接而导致 DNA 片段的交换和重新组合，进而形成新 DNA 分子。痘病毒基因组十分庞大，因此将外源基因插入至羊痘病毒非编码区，即不影响其复制又不会影响其抗原性，也能够表达多个外源基因，基于以上原因羊痘病毒是作为其他病毒病源基因的载体研发重组疫苗的最佳选择经过动物实验证明，这种重组疫苗对山羊抗 PPRV 的最低保护剂量为0.1pfu[100]。Berhe 等构建了含有小反刍兽疫（PPRV）致病基因的重组痘病毒，并且可快速有效的筛选了高纯度的重组病毒克隆。在重组疫苗中只存在 PRRV 一种糖蛋白，因此若伴有特异性血清学检测诊断方法，这种新型重组疫苗可以作为标记应用于 PPR 流行病学调查。迄今为止，已有将牛瘟病毒和小反刍兽疫（PPR）基因克隆于羊痘病毒载体而成的重组疫苗，能够同时对羊痘、牛瘟、小反刍兽疫三种疾病起到预防保护作用[101]。

　　8 综合防治

　　针对羊痘治疗尚无特效药，对该病的控制应采取预防为主、防重于治的原则[102]。

　　8.1 预防

　　8.1.1 日常饲养管理工作

　　羊舍必须建于开阔地，保证羊舍能够维持良好的通风和光照；建立严格的隔离制度，人员进行养殖生产区前必须进行消毒并更换配套的防护服及清洁过的鞋子；定期消毒，每月进行一次，至少每季度一次，羊场、圈舍及羊道出入口处设置消毒池，内置 3%烧碱溶液，每天更换一次。

　　8.1.2 接种免疫及控制疫情

　　严禁从疫区购买种羊，若必须购买，则需对当地疫情进行调查，引种后认真对种羊进行消毒检验，并隔离观察一个月，在此期间无发病迹象方可混入羊群中；在羊痘常发地区，每年定期全群接种羊痘疫苗，一般使用弱毒活疫苗，剂量为0.5ml/头，免疫期为一年；如发生羊痘疫情，对疫区羊群迅速进行隔离，严禁混群，并立刻上报畜牧业相关部门，由政府进行决策，发布封锁令，疫区 3 个月内，严禁羊只流动和放牧，于此同时使用 2%烧碱、10%~30%石灰乳剂进行严格消毒，对于病死羊尸体必须进行焚烧或深埋，以免其成为传染源[103]。

　　8.2 治疗
　　
　　目前针对羊痘虽无特效治疗方法，但对病羊进行隔离并对症治疗，可在一定程度上起到治疗的效果。现在治疗羊痘使用的药品中，中药的治疗效果较好。在皮肤出现痘疹的位置涂抹碘酊或紫药水，黏膜上的病灶用 0.1%高锰酸钾清洗后，涂抹碘甘油，一日三次，持续数日，直至皮肤结痂[104]。

　　中药治疗使用柴葛解肌汤可起到良好的效果。药物处方为：柴胡 12g、葛根8g、升麻 8g、牛子 5g、薄荷 3g、桔梗 8g、元参 10g、金银花 12g、山豆根 12 g、板蓝根 15g、蒲公英 20g、黄岑 12g、连壳 15g、甘草 6g、加水适量一煎至 20min后，澄清滤过取液第二次加水适量一煎至 20min 澄清过滤取液后，同前煎液混匀与饮水槽内，供自由饮用，每日早晚一次，给药 3d 后经临床观察体温下降至 39℃，食欲增加，痂皮脱落症状消失[105]。此外，使用黄连解毒汤同样也可以起到缓解症状进而治疗的目的,黄连解毒汤处方为：黄连 9g、黄岑 9g、黄柏 9g、栀子 9g、薏米仁 15g、丹皮 9g、泽泻 9g、滑石 15g、赤苓 9g，水煎服用，每日一剂，连服 3d，治疗效果同样良好[106]。

　　为防止继发感染，在采用上述疗法的同时，还可进行对症治疗。青霉素 80万 U、链霉素 50 万 U、病毒灵 10mg/Kg 体重，混合肌注，2 次/d,连用 2～3d。抑或使用黄芪多糖静脉注射液注射 0.1～0.2ml/Kg，痘疮清（甲磺酸培氟沙星注射液）2～4mg，0.9%生理盐水 250ml，1 次/d,连用 3d[107]。