二维液相色谱在药物代谢和体内分析中的应用

　　1 引 言

　　药物代谢和药代动力学( DMPK) 定量描绘药物及其它外源性物质经过各种途径进入机体后的吸收、分布、代谢、排泄过程及其机制,阐释机体对药物的处置、揭示药物在体内的生物转化以及与内源性和外源性物质的相互作用,为新药研发和临床安全、有效和合理用药提供科学依据。生物样品中药物及其代谢产物的定性与定量分析,是药物代谢研究的关键环节,复杂生物基质中低浓度药物和代谢产物的检测、定量分析和结构鉴定常是一个挑战性工作[1]。同时,在疾病发现和诊断、药物对机体的药效学研究、临床用药监测以及滥用药物和毒物的中毒分析中,也涉及大量的体内生物样品的分析,其对象包括血浆、血清、尿、唾液、胆汁等各种体液,以及组织样品和排泄物。药代动力学和其它生物分析的样品基质均较复杂,干扰物多( 蛋白质、脂肪、激素、神经递质和尿素等代谢物等) ,取样量少,待测物浓度与内源性物质相比明显偏低,因此要求生物分析方法的特异性强、灵敏度高、重现性好。药代动力学研究和临床药物监测需要分析大量样本,对分析的通量和方便简便快速也有要求。目前,生物分析和药代动力学研究首选色谱法,连接不同类型的检测器( 紫外、荧光、电化学、质谱等) 的液相色谱可以适应不同类型化合物的检测,应用最为广泛。在过去的十多年中,随着质谱接口技术的快速发展和分析灵敏度的提高,选择性强、灵敏度高的液相色谱-质谱联用技术( LC-MS) 已成为药代动力学研究及其它药物毒物生物分析的主导技术[2],其中,液相色谱的分离功能对于复杂基质或多组分样品分析的灵敏度、重现性和准确性至关重要。二维液相色谱的出现,大大提高了分离效率,为这些样品的分离测定提供了有力工具[3]。

　　血浆、尿、组织等生物样品的成分复杂,在应用 LC-MS 及时进行定性与定量分析时,一般需要进行样品的前处理,这是极为重要的环节,也常是最困难、最繁复的工作。前处理在复杂基质样品分析中是最为耗时的部分,其结果将直接影响定性与定量分析结果的可靠性。有人认为,约 1/3 的分析误差是由繁琐的前处理步骤产生的[4],并占据了约 2/3 的工作量[5]。基于二维液相色谱的在线固相萃取技术,显着简化了样品前处理工作,使得高通量的全自动样品分析成为可能,在中药有效成分分析、药物质量分析、食品安全、环境科学等诸多领域得到广泛应用[6~9]。近年来,这一技术在药物代谢和生物分析中得以应用,并逐渐显示优势。

　　2 在线二维色谱原理、装置及特点

　　二维液相色谱是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统,通过柱切换技术完成样品在二维色谱柱之间的流动。分析时,样品经过第一维色谱柱的分离,进入切换阀的接口中,经捕集或切割后,被切换进入第二维色谱柱及检测器。二维色谱按切割组分进入二维柱方式分为中心切割和全二维方式; 又可根据切割组分是否直接进入二维柱中,分为离线与在线两种类型。目前用于分析的二维液相色谱大多应用在线方式,即一维洗脱产物全部或部分直接进入到二维色谱柱中进行分离分析。

　　在装置方面,单泵系统与双泵系统均能实现在线二维液相色谱分离[10]。双泵系统可以采用临时搭建的方式或者选用整合式色谱仪。图 1A 所示的双泵系统通常需要使用者额外添加一个泵、色谱柱和切换阀,以实现多条流路的切换。样品首先通过一维泵将样品装载至一维色谱柱中进行洗脱分离,使用双样品环接口、停流模式或真空挥发的接口切换技术捕集洗脱产物,再用高浓度的二维泵流动相将保留在接口或一维柱上的分析物以正冲或者反冲模式从一维转移到二维分析柱上继续分离,由此能够获得更大的峰容量[11,12]。整合式色谱仪整合了二维色谱所需的双泵、管路套装与连接指导,例如 Ulti-Mate3000 型液相色谱仪,通过软件操作和独特的阀切换技术 ( 图 2) ,实现在线二维色谱的多种应用[13,14]。应用单泵系统,如图 1B 所示,也可以实现二维色谱的操作[15,16],输液泵将样品装载至 SPE 柱中,并将不保留物质冲洗至废液中,之后关闭废液位置,迫使梯度流动相经 SPE 柱流向分析柱。
　　
　　与传统的液相色谱和离线固相萃取色谱分析相比,在线二维色谱的优势在于峰容量明显提升、复杂样品的基质效应和残留现象显着降低、以及自动化样品前处理以提高分析的通量。在一维色谱模式下,如果峰数量超过了峰容量的 37%,色谱峰分辨率将明显下降,而二维色谱的峰容量是一维与二维色谱分离峰容量的乘积[17~19],分离效率大大提高,因此可以用于多组分、复杂基质样品的分离分析。将二维色谱的其中一维配置固相萃取柱,可以完成自动固相萃取、脱盐和除蛋白、以及低浓度分析物的富集,复杂基质样品可直接进样,样品的自动化前处理显着改善了基质效应和残留现象,提高分析的灵敏度和重现性,满足大批量样品的全自动和高通量分析要求。除此之外,由于整个分析过程在密闭系统中进行,可以减少样品污染及可能发生的分析物降解[9,20,21]。

　　3 二维液相色谱在药物代谢和体内分析中的应用

　　3.1 新药发现和临床前药代动力学研究

　　新药发现阶段的代谢性质早期评价涉及大量化合物的快速筛查评价,体外评价实验通常在 96 孔板上进行,分析方法的通量对于评价效率至关重要。Janiszewski 等[22]应用在线固相萃取-质谱技术建立了高通量的体外药物代谢稳定性评价方法。他们用自己搭建的在线双 SPE 柱固相萃取-液质系统,每个样品分析时间 43 s,双柱的交替样品萃取可以实现每天 2000 个样品的高通量评价。Luippold 等[23]采用相似的方法建立了超快速在线固相萃取进样系统,分析速度进一步提高至每个样品仅需 8 s,并将该方法用于 CaCo-2 细胞和 PAMPA 膜的新药体外跨膜吸收性质评价,大大提高了分析速度和样品通量。基于在线固相萃取-液质联用技术的生物样品自动化分析,以及双柱,甚至多柱交替萃取方法,可显着提高新药设计和优化期大量化合物成药性筛选评价的效率。

　　临床前药代动力学研究在实验动物上评价药物或候选药物的吸收、分布、代谢和排泄性质,涉及的分析物类型多,不同分组和剂量产生大量的血浆、组织和排泄物样品。在线固相萃取因其能提高样品前处理的效率、降低生物样品的干扰和基质效应、保证分析的灵敏度和重现性,已成为药代动力学研究中高通量样品分析最有潜力的技术之一[24],在血浆动力学[25~27]、组织分布浓度测定[28]、尿排泄[29]研究中得到广泛应用。例如,为了满足临床前药物开发高通量的要求,Ong 等[30]比较在线单柱和双柱模式测定血浆中尼莫地平浓度,结果表明,单柱模式的分析时间为 4 min,而并联双富集柱的分析时间仅为2 min,分析速度提高了一倍。为此,他们采用如图 3 所示的双富集柱模式,提高分析速度,并进行了代谢稳定性、蛋白结合和 CaCo-2 单层细胞通透性等体外代谢性质的快速评价。生物样品中药物浓度通常较低,血浆药代动力学研究一般要求方法的最低定量限在 μg/L 或更低的水平。当实验室不具备液相色谱-质谱联用仪时,通过优化前处理方法进行样品清洁和待测物富集,可有效提高液相色谱检测方法的灵敏度。Shang 等[31]采用在线 SPE-HPLC-DAD 法方法,同时测定自发高血压大鼠血浆中尼群地平和氢氯噻嗪,在线固相萃取的血浆样品,直接进样量可提高至 100 μL,尼群地平和氢氯噻嗪的最低定量限( LLOQ) 分别降低至 0.5 和 0.6 μg/L,满足了尼群地平和氢氯噻嗪的血浆药代动力学研究要求。

　　3.2 药物代谢产物和代谢酶研究

　　代谢产物的定性和定量分析是药代动力学研究中具有挑战性的工作。为了检测到血、尿等杂基质中的微量未知代谢产物,有效去除内源性杂质,降低背景干扰就尤为重要。Mullett 等[32]采用双 SPE 柱的串联模式,研究了维拉帕米的代谢产物。他们先利用 RAM( Restricted access material) 柱清除样品中蛋白质等大分子基质,再用 MIP( Molecularly imprinted polymer) 柱去除小分子杂质后,样品进入分析柱中经 LC-MS 进行维拉帕米及其代谢产物分离鉴定。单 RAM 柱和 RAM-MIP 柱串联的比较结果显示,双SPE 柱串联洗脱模式能够显着降低背景杂质干扰,更有利于代谢产物的鉴定。

　　抗癌药 5-氨基咪唑-4-氨甲酰( AICA) 核糖苷与其活性代谢产物 AICA 核糖酸的结构非常相似,差异仅在于前者是正离子化合物,而后者是阴离子化合物。由于它们的离子化效率偏低,LC-MS 方法不适用于二者的同时检测。Cheng 等[33]建立了同时测定荷瘤裸鼠血浆中 AICA 核糖苷和 AICA 核糖酸浓度的二维 HPLC-DAD 方法,并成功用于荷瘤小鼠的药代动力学研究。血浆样品用三氯乙酸进行蛋白沉淀后,再经乙醚萃取以去除三氯乙酸,取水层 50 μL 进样至在线 WAX-1 SPE 柱中,WAX-1 柱只保留阴离子化合物,因此 AICA 核糖苷被洗脱至二维柱( IonPac CG16 柱) 上进行色谱分离和 DAD 检测,保留的AICA 核糖酸经阀切换后,洗脱至二维柱( HILIC-10 柱) 进行分离,由于经相对吸收光谱法评价峰纯度后发现 AICA 核糖酸在 12.6 min 的出峰处仍存在杂质干扰,因此待 AICA 核糖酸从 HILIC-10 上被洗脱后,再串联了一根 WAX-1 柱作为分析柱,对 AICA 核糖酸进行分离测定,虽然分析时间需要 40 min,但该方法不仅能够同时检测 AICA 核糖苷和 AICA 核糖酸,而且灵敏度更高,LLOQ 低至 100 μg/L( AICA 核糖苷) 和 30 μg/L( AICA 核糖酸) 。这个实例表明,在分离分析与内源干扰物性质相近的药物及代谢产物时,二维或多维色谱技术是有效的解决方案,通过不同分离模式间的组合可有效解决复杂体系中的相似物质的分离。

　　药物对代谢酶的抑制和诱导作用的评价,可以为药物临床合理应用提供信息或依据。Barrett 等[34]建立了在线固相萃取-LC-MS 方法定量分析人尿样中氢皮质醇和 6β-羟基皮质醇浓度,以皮质醇和 6β-羟基皮质醇的浓度比值作为体内细胞色素 P4503A4 酶活性评价的指标。该方法快速灵敏,定量限为1 μg / L ( 6β-羟基皮质醇) 和 0.2 μg / L( 皮质醇) 。Lim 等[35]利用在线固相萃取液质联用技术,在 96 孔板上建立了高通量的细胞色素 P450 酶活性抑制评价方法。方法可平行评价 12 种化合物( 每种化合物8 个浓度) 对 6 个细胞色素 P450 酶亚型的抑制作用,每块 96 孔板的分析时间仅为 14 min,比以往报道的需要 4 h 每板的 2-min LC-MS/MS,分析速度提高了 15 倍,实现了新药候选物代谢酶抑制的快速评价。

　　3.3 人体血药浓度监测

　　临床药物的血药浓度监测是临床合理用药和个体化用药的重要依据,对于那些有效浓度与中毒浓度相差较小,治疗窗较窄的药物,尤其重要。治疗方案优化和血药浓度监测需要有简便、快速、重现性好的生物分析方法,无需繁复前处理的在线固相萃取技术得到了众多应用[36~38]。紫衫萜、坦西莫斯及其活性产物西罗莫司是常用的广谱抗肿瘤药,它们治疗窗窄、且由于受个体差异影响大其血药浓度变幅较大,通常需要进行血药浓度监测。Navarrte 等[39]采用自动在线固相萃取-液质联用方法对人全血和血浆中的紫衫萜、坦西莫斯及其西罗莫司进行检测,血浆样品经过简单蛋白沉淀后即直接进样分析,整个过程仅用10 min,检测灵敏度为 0.14~0.76 μg/L,适用于临床化疗时药物剂量的调整以及联合用药时药物相互作用的评价。茚达特罗是治疗慢性阻塞性肺病的药物,经特殊吸入装置给药,血浆中药物含量较低。Emotte 等[40]利用在线固相萃取技术实现茚达特罗在 SPE 柱上浓缩富集,应用液质联用仪分析检测,灵敏度达到 10 ng/L,与离线 SPE 柱前处理的结果对比,二者之间的相关性良好,在线方法更快捷灵敏,可用于大批量临床样品的分析。因此,对于临床用药监测中的大量常规血样或尿样的定量分析,二维色谱技术有助于减少样品前处理,提高分析的自动化程度,进而提高分析的准确性和重现性。

　　3.4 违禁药物及毒物监测

　　对于体内滥用药物和毒物中毒的分析监测,同样要求能够对样品进行快速检验,其中快速灵敏的在线固相萃取技术已得到广泛应用[21,41]。梁晨等[42]建立了在线的二维 LC-MS 方法,测定分析吸毒者尿样中的吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因和乙酰可待因,方法灵敏度高、又有效避免了单抗试剂盒可能出现的假阳性,可满足实际案例快速检验的需要。Bouzas 等[43]比较了在线并联 SPE-LC-MS 方法与传统的离线 SPE-GC-MS 方法测定人血清中基本滥用药物及其代谢产物浓度( 如吗啡、可待因、苯丙胺等) 优劣性,在线 SPE-LC-MS 能够高通量地满足临床和法医血清样品的常规分析要求。Guo 等[44]通过在线固相萃取技术测定人尿样中 4 种促雄激素合成激素,该方法简便、快捷、特异性好,且避免了使用 GC-MS 分析前不稳定的衍生化程序,同时可以 1 mL 尿样直接进样,使灵敏度比以往的方法提高了 10~100 倍( 0.01 μg/L) ,为促雄激素合成激素的临床监测以及兴奋剂检查提供了一种实用的便捷手段。Mueller等[45]利用线固相萃取-LC-MSn和自建的质谱数据库建立了能够灵敏特异测定血浆、血清和尿样中 453种化合物的快速毒物筛选系统,并成功应用于急症和深切治疗病患的血尿毒物分析,方法中 78%的化合物定量限低于临床最低治疗浓度,与大多数报道方法需要 1 mL 样品量相比,该法需要样品量更少( 100 μL) ,且 45 min 内即可获得毒物分析报告,适用于大量样品的筛查和常规分析。

　　3.5 内源性物质或生物标志物的检测

　　生物标志物是一种能够反映生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标,对于健康状况、疾病的快速诊断治疗、早期药物筛选具有重要意义,同样地,高效灵敏的二维液相色谱在头发、唾液和组织中内源性物质及生物标志物中也有较广泛的应用[46~48]。8-羟基-2’-脱氧鸟苷( 8-OHdG) 是 DNA 氧化损伤的生物标志物,可以用以评价药物毒物引起的 DNA 损伤毒性,经典的分析方法包括电化学检测法和免疫检测法。Wang 等[49]利用在线固相萃取-液质联用技术测定人血浆中的 8-OHdG 含量,方法不仅省时省力,还可避免电化学检测法中内源性物质的干扰和免疫检测特异性低的问题,方法可用于评价疾病状态以及人体接触纳米颗粒后的氧化应激状态。

　　人体前列腺素 E2( PGE2) 由前列腺素 E2 合成酶-1 合成,在炎症反应、疼痛、发烧和血管调节中发挥了重要作用。Fabian 等[50]通过测定 A549 微粒体孵育体系中前列腺素 E2含量,筛选微粒体前列腺素E2 合成酶-1( mPGES -1) 抑制剂。他们建立了在线固相萃取-HPLC-UV 方法,分别设计了单 SPE 柱和并联 SPE 柱交替模式,并进行比较。结果证明,在线固相萃取法不需要任何前处理,灵敏度达到 57 μg/L;与单柱相比,并联双柱模式分析时间显着缩短,为 mPGES -1 抑制剂的筛选提供了快速可靠的方法。同样,Heinig 等建立在线萃取技术,以小鼠血浆、尿液和组织中糖皮质激素浓度水平作为生物标志物,进行11β-HSD1 抑制剂候选药的药效评价[51]。

　　内源性脑神经肽是重要的内源性调节剂,由于其含量较低和大脑组织基质的复杂性,使得定量测定很困难。一维液相色谱在测定脑神经肽时难以获得足够的分离度。Mihailova 等[52]建立了两套在线二维液相色谱系统,即 HILIC-RP 和 SCX-RP 色谱系统,通过比较确定适用于缺氧应激条件下大脑神经肽含量测定方法。实验结果显示,HILIC-RP 系统可在一维柱分离后得到 19 个肽段,而传统的 SCX-RP 系统的实际局限性仅得到 6 个,HILIC-RP 系统比 SCX-RP 系统获得多于 3 倍的肽段信息,表明 HILIC-RP系统更适合脑神经肽的肽段组学比较研究。同时,为了防止 HILIC 和 RP 柱不兼容的问题,在两柱间再加了一根 SPE 柱,使得流动相间的切换能够平稳过渡。

　　3.6 手性化合物的分离和分析

　　在药物研究中,常常需要对样品中不同药物或药物手性异构体进行分离,二维液相色谱是手性化合物分离的有力工具之一。Mangani 等[20]建立了多柱在线切换-HPLC 技术对血清中常用的 6 种治疗心血管疾病药物进行分离测定,其中 β 受体阻断剂吲哚洛尔是手性药物。血清样品先经过在线 SPE 进行纯化,纯化样品洗脱进入RP-18 柱,用pH 2.5 的流动相洗脱,将吲哚洛尔与其它药物完全分离,后者经 UV 检测; 随后通过中心切割,将吲哚洛尔引入手性 AGP 柱以 pH 7.0 的流动相进行二维手性分离分析。通过对流动相 pH 的调整,同一二维色谱法也可应用于其他药物及其代谢产物的分离。Bester 等[53]则应用在线二维液相色谱法分离检测生物样品( 鱼油、灰欧肝等) 中的六溴环十二烷( HBCD) 。市场上HBCD 是 3 种异构体 ( α-HBCD,β-HBCD 和 γ-HBCD) 的混合物,且每种异构体还存在手性异构,尽管通过手性柱可以手性分离异构体,但 3 种异构体间的完全分离非常困难。Bester 等[53]的方法分别用Synergi polar plus 柱和 Nucleodex beta-PM 柱作为一维和二维柱,待测物先在一维柱上使异构体达到分离,再通过中心切割进入二维柱实现各手性异构体的分离。与以往的单柱或是串联柱方法相比,该方法的分析物色谱峰不受其它异构体峰或杂质峰影响,有效峰容量提高了 2 倍,各异构体在二维色谱上达到更充分的分离。

　　4 展 望

　　经过十余年的快速发展,无论在仪器设备、技术上、还是在应用扩展方面,二维液相色谱均有显着进步。在原有液相色谱的基础上增加简单配置,如添加一个泵和六通阀,实现在线二维液相色谱。色谱仪器厂家也已开发出了多种整合式的在线二维液相色谱系统,如 UltiMate 3000 型液相色谱仪、Rapid-FireTM SPE-MS 系统等。目前,二维液相色谱多采用在线模式与质谱相连,成功应用于各种复杂基质样品中的小分子药物和大分子蛋白等的分析。本文总结了近几年在线二维液相色谱在药物代谢领域,以及体内药物、毒物和内源物生物分析方面的应用进展。大量应用实例展示了在线二维液相色谱在复杂生物样品中药物、毒物和内源物分析中的优势,为生物分析中常见的基质干扰、前处理方法繁琐、通量低、重现性和准确性较差等问题提供了有效的解决方案,近年来在药代动力学研究及其它生物样品的分析中得以广泛应用。

　　但是,二维液相色谱的应用推广还有一些问题需要进一步解决。例如,二维色谱柱系统选择和方法建立,以及流动相的选择和匹配相对复杂,需要繁琐的软件设置和支持,对专业知识和技能有一定的要求;因兼容性问题,进入二维柱的样品常需要稀释,导致方法灵敏度降低,影响生物样品中痕量化合物的检测;以及固相萃取柱和色谱柱的选择性和可用性的限制等。随着二维液相色谱的不断发展完善,以及应用面的扩大和经验的积累和总结,这一技术在体内药物、毒物和内源性物质分析中将具有良好的应用前景。