第4章 低场核磁共振快速检测甘油三酯含量
4.1 前言
简单的来说，核磁共振是由于能级之间迁移产生的，相邻的两个能级之间可以发生跃迁[63].具有固定磁矩的原子核，在恒定磁场与交变磁场的作用下，与交变磁场发生能量交换的现象[64].在交变磁场中，处于低子能级的原子核吸收交变磁场的能量向高自能级跃迁，产生核磁共振吸收的现象[65].
核磁共振技术用于脂肪测量可采用直接法和间接法两种方式[66].核磁共振技术可以快速、准确的帮我们分析出含油脂食品内部水分和脂肪的分布状况，利用低场核磁共振技术分别测定其内部的水分、脂肪的T2弛豫时间和弛豫面积，且不会对食品造成损害。检测到的NMR信号强度直接和样品中的氢质子数量成正比，并且NMR信号是按恒定时间常数衰减，这个时间常数称为2T驰豫时间并受分子的迁移性影响[67].随着人们对食品品质劣变机理的研究不断深入，低场核磁共振技术将对食品科学领域的研究产生重大影响[68].
核磁共振（NMR）技术是较好的取代传统测定固体脂肪含量（SFC）的仪器分析方法[69],目前，国际标准化组织（ISO）已经颁布了利用NMR技术无损同步检测油料种子含油量、水分含量以及动植物中SFC的五项检测标准，国内NMR技术在食品行业的应用主要集中在测定油料种子含油量和SFC方面。Chaland等人[70]应用LF-NMR技术研究奶酪中水和脂肪的分布状态，反演后的T2图谱出现四个峰，根据弛豫时间的不同，得出17μs左右的2T值为固体脂肪弛豫时间，大于1000μs的2T值分别对应体系内水、液体脂肪和蛋白质的弛豫时间。
本章通过利用核磁共振技术测定不同油样中的甘油三酯含量，来鉴定油脂的好坏。一方面，研究甘油三酯图谱的特性以及甘油三酯弛豫面积与甘油三酯体积的线性关系；另一方面，利用核磁共振技术测定不同油样的甘油三酯弛豫面积以及弛豫时间，通过计算、对比甘油三酯含量，以期找到正常食用油与地沟油在甘油三酯含量上的差别，进而达到鉴别检测地沟油的目的。
4.2 材料与方法
4.2.1 材料与设备
4.2.1.1 试验材料
16种油样：餐厨废油2号、久置自榨散装花生油、久置自榨散装芝麻油、自榨散装菜籽油、久置市售品牌花生油、久置市售品牌芝麻油、久置市售品牌大豆油、久置市售品牌菜籽油、煎炸老油7号、餐厨废油3号、市售品牌大豆油1号、市售品牌玉米油1号、市售品牌芝麻油1号、市售品牌花生油1号、市售品牌菜籽油3号、市售品牌菜籽油4号。
甘油三酯标准品（GLC-768甘油三酯混标GLC-768,15组分）：北京博研科创生物技术有限公司。
4.2.1.2 仪器与设备
低场核磁共振仪：MQC-23型，英国牛津仪器公司；核磁试管：英国牛津仪器公司；移液枪恒温水浴锅.
4.2.2 试验方法
开机后打开检测软件→进入仪器参数设置界面，选择FID模式→将标准样管放入磁体单元的射频线圈→自动调整中心频率，得到O1值→自动调整P90和P180→自动调整RG→关闭FID界面→选择CPMG模式→将质量较大的检测样品放入磁体单元的射频线圈→依次设置RD、SW、TAU、NECH、NS→保存参数→进行多次信号采样→根据比例调整各参数大小直至衰减曲线衰减完全。
仪器的序列参数主要包括：重复采样等待时间RD、接收机带宽SW、半回波时间TAU（τ）、回波个数NECH和重复采样次数NS.
重复采样等待时间RD:通常指前一次采样结束与后一次采样开始所等待的时间。RD值的大小的选择以使体系核子弛豫完全为标准，RD值的合理设置是最短的时间内采集到样品信号最大幅度的保障。通常RD值为样品T1值的5倍，如纯水的RD值为10s以上，纯油的RD设置为1s左右。本试验的对象油样为液体样品，RD值设置为1s.
接收机带宽SW:表现为仪器的信号采样频率，SW为10KHZ,表示每隔1μs仪器就会采集一次信号。通常状况下，SW最好不小于100KHZ,若SW太小，采样频率降低，导致有效信号采集不完全，对于固体等信号弛豫速度很快的样品，应增大SW.在检测油样时，设置SW=250KHZ.
半回波时间TAU（τ）：是指各脉冲序列的时间间隔，通常90°脉冲与相邻180°脉冲之间的时间间隔为τ，而相邻180°脉冲之间的时间间隔为2τ。弛豫图谱信号形状随τ值的变化而变化，当τ值较大时，弛豫峰较陡，顶点较尖；当τ值较小时，形成的弛豫峰较为平缓。重复试验表明。当τ=150μs时，形成的峰型符合CPMG序列的回波形状。
回波个数NECH:是指施加180°脉冲的数量，也是信号采样得到的回波数量。回波采集总时间=回波个数×回波时间，即为弛豫曲线横坐标的时间长度。在信号采集时，要求回波采集总时间略大于或等于弛豫曲线的长度。因此，在确定TD与SW的大小后，NECH可通过公式：
TD/SW≧2τ×NECH×10-3计算得到。在本试验设置的NECH=5000个。
重复采样次数NS:NS值必须是偶数（≧4次），NS与信噪比有关，当NS越大，采样信号的信噪比越高，采样所需时间越长。由于油脂的信号强度相对较强，一般将NS确定为4次即可。
设置参数：经过不断的参数优化，最终决定扫描频率为23.4MHz,探头死时间为10μs,900和1800脉宽分别是3.3μs和6.6μs,90°和180°脉宽的间隔时间t为150μs,采样点数：168140,回波个数为5000,重复采样次数为4,两次扫描之间的重复时间RD为1s,增益倍数为6.4,分光仪的频率（SF）为23.40000MHz,偏移量为-54578.98,保压时间为10.0μs,扫探宽度为100000.0HZ,重复数量为4096,扫描频率为8,一阶相位校正的轴心点为0,峰相对阈值选择器为4.0.
（2）甘油三酯弛豫面积与甘油三酯添加量相关性的检测：分别将梯度为1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL的甘油三酯加入到核磁管中，在32℃的水浴中稳定10min后擦干试管外壁，置于核磁探头中稳定1min,在设定的参数下进行检测，平行测定三次。
（3）16种油样的甘油三酯的检测：分别取4mL不同油样加入到核磁试管中，在32℃的水浴中稳定10min后擦干试管外壁，置于核磁探头中稳定1min,在设定的参数下进行检测，平行测定三次。
（4）分析：利用winDXP软件进行分析。可以从分析图中看出峰的个数，查找出甘油三酯的特征峰。同时记录2T即甘油三酯弛豫时间，以及甘油三酯弛豫面积，计算出每种油样甘油三酯的平均弛豫面积，据此计算出甘油三酯的含量。
4.3 结果与讨论
4.3.1 分析油样的核磁图谱
4.3.1.1 甘油三脂特征峰的确定
核磁共振检测得甘油三酯标准品核磁图谱如4.1所示，检测油样核磁图谱如4.2所示。
由图4.1可知甘油三酯的特征峰出现在100,000μs左右，对比图4.1、4.2可知，油样核磁图中较大的峰为甘油三酯的特征峰，较小的峰为油样中所含的其它物质的特征峰，在这里可视为杂质峰。并且经过对比不同油样的核磁图谱可知，品质好的油样杂质峰极小，随着油样品质的劣变，杂质峰变大，并且发生右移现象，即杂质的流动性会减小。以下的试验就在100,000μs左右读取不同油样中甘油三酯的特征峰，并记录甘油三酯的弛豫面积与弛豫时间。
4.3.2 甘油三酯含量与核磁共振参数的相关性分析
4.3.2.1 绘制甘油三酯标准品添加量与甘油三酯的弛豫面积的标准曲线
通过试验，得到甘油三酯体积与甘油三酯的弛豫面积的相关性如表4.1所示。
以甘油三酯体积为横坐标，甘油三酯弛豫面积为纵坐标作图，得到如图4.3所示的标准曲线。
由图4.3可得，甘油三酯的标准曲线的线性关系方程为：
y=7056.4x+342.05,相关系数R2=0.9997.
4.3.2.2 测定16种不同油样中的甘油三酯含量
（1）通过2T值来比较组分的流动性强弱
弛豫面积可以表示对应组分的相对含量，而横向弛豫时间2T可以反映样品组分的自由度，即组分的流动性强弱。
2T值越小，组分的流动性越小，结合越紧密，2T值越大，组分的流动性越大，结合越不紧密。即通过甘油三酯的弛豫时间2T值可以来比较16种不同油样的脂肪组分的流动性强弱，从而确定油质的好坏。16种不同油样的甘油三酯的弛豫时间2T如表4.2所示。
通过表4.2可以比较出16种不同油样脂肪流动性强弱，2T值越小，结合越紧密，2T值越大，结合越不紧密。由表4.2可知，16种不同油样的脂肪的流动性强弱依次为：粗制潲水油<久置自榨散装花生油<久置自榨散装芝麻油<自榨散装菜籽油<久置市售品牌花生油<久置市售品牌芝麻油<久置市售品牌大豆油<久置市售品牌菜籽油<煎炸老油7号<精制地沟油<市售品牌大豆油1号<市售品牌玉米油1号<市售品牌芝麻油1号<市售品牌花生油1号<市售品牌菜籽油3号<市售品牌菜籽油4号。从流动性的强弱可以看出油质的好坏，流动性越弱，说明油脂酸败氧化程度越高，产生的过氧化物或聚合物越多，即油样的品质越差。
（2）通过弛豫面积来计算甘油三酯的含量
通过试验，得到不同油样的弛豫面积数据见表4.3.
将表4.3中的平均弛豫面积代入到4.3.2.1中的线性方程中，得到16种不同油样的甘油三酯含量，如表4.4所示。
由表4.4可以看出，16种不同油样的甘油三酯含量由小到大的次序为：粗制潲水油<久置自榨散装花生油<久置自榨散装芝麻油<自榨散装菜籽油<久置市售品牌花生油<久置市售品牌芝麻油<久置市售品牌大豆油<久置市售品牌菜籽油<煎炸老油7号<精制地沟油<市售品牌大豆油1号<市售品牌玉米油1号<市售品牌芝麻油1号<市售品牌花生油1号<市售品牌菜籽油3号<市售品牌菜籽油4号，其中市售品牌油样甘油三酯的含量都在97%以上；粗制潲水油的甘油三酯含量很低，只有61.07%;但精炼地沟油的甘油三酯含量达到96.55%,达到正常油脂的标准。由此可知，正常食用油与粗制地沟油在甘油三酯含量上有较大差异，精炼后的地沟油甘油三酯含量可达到正常油脂的标准。
4.4 本章小结
通过核磁共振技术考察了甘油三酯的弛豫面积与含量的相关性，利用核磁共振技术检测了不同油样中甘油三酯的含量，并进行了分析、对比。结果表明，甘油三酯驰豫面积与其含量有相关性，相关性方程为y=7056.4x+342.05,相关系数为R2=0.9997.市售品牌油样甘油三酯的含量都在97.00%以上；粗制潲水油的甘油三酯含量很低，只有61.07%;但精炼地沟油的甘油三酯含量超过了95.00%,达到正常油脂的标准，久置油样却低于正常油脂的标准。由此可知，正常食用油与粗制地沟油在甘油三酯含量上有较大差异，精炼后的地沟油甘油三酯含量可达到正常油脂的标准，久置油样属于问题油样。该法不需溶剂、可进行无损检测，相比利用核磁共振测定固体脂肪含量来鉴别地沟油而言，更加简单快速，并且受温度影响较小，但目前优化的核磁共振参数只适用于粗制地沟油的快速鉴别检测。
