VC对树突状细胞成熟、分化及其免疫功能的影响(2)

　　1. 3. 2 DC 细胞培养 外周血单核细胞悬浮于 1640培养基中，调整浓度为 108ml-1,于 48 孔细胞培养板上贴壁。在37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养 3 ~ 6 h后，收集悬浮细胞，贴壁细胞 PBS 荡洗两次后为 DC前体细胞，于显微镜下观察计数，加入 1640 培养基：GM-CSF（ 800 U / ml） 和 IL-4（ 1 000 U / ml） ,细胞浓度约为106ml-1并继续培养。

　　1. 3. 3 实验组设置 于 48 孔板细胞培养液中加入不同浓度 VC,浓度梯度为0 μmol/L、100 μmol/L、250μmol/L、500 μmol/L,1 mmol/L、2. 5 mmol/L.贴壁的DC 前体细胞洗涤后，加入上述浓度 VC（ RPMI1640,10% FBS,GM-CSF 800 U / ml 和 IL-4 1 000 U / ml） 孵育24 h,洗涤，之后培养液 RPMI1640,10% FBS,GM-CSF800 U / ml 和 IL-4 1 000 U / ml 培养。

　　1. 3. 4 CD80、CD86、CD40、CD40L （ CD154 ） 以 及HLA-DR 表达分析 DC 细胞经吹洗后悬浮，用 FITC-CD86mAb、 PE-CD80mAb、 APC-HLA-DR、 FITC-CD40mAb、PE-CD40L （ CD154） mAb 标记 DC 30 min之后上流式细胞检测仪进行检测分析。

　　1. 3. 5 荧光倒置显微镜观察 VC-DC 抗原捕获能力NY-ESO-1 是目前证实最具免疫原性的肿瘤-睾丸抗原（ CT-Antigen） 之一，其155 ~167 位点是其发挥免疫原性的核心抗原决定簇。本项目组将 NY-ESO-1155-167与荧光素 FITC 共价合成，与 VC-DC 孵育2 h 后洗涤（ 10 ng/ml） ,并在荧光显微镜下观察。通过荧光灰度检测，对比未加 VC 培养的 DC 细胞荧光强度。

　　1. 4 统计学分析 应用 SPSS21 系统分析软件进行分析。数据均以 x±s 表示，两样本均数的比较采用配对的 t 检验，多样本均数的比较采用方差分析，方差不齐用秩和检验，检验水准 α=0. 05.P<0. 05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2. 1 形态学观察 较之未添加 VC 实验组，DC 培养过程中加入 VC 可显着提升 DC 的成熟速度及分化程度。细胞形态学观察显示，随着培养时间的延长，DC表现为细胞悬浮生长，体积变大，树突状分化显着（ 第三天） （ 如图 1A ~ D） ,同时呈现出对 VC 的浓度依赖性。

　　2. 2 VC 可上调 DC 表面 CD80、CD86 表达 氧化还原（ Redox） 调节反应是细胞内一种普遍的调节方式。

　　研究显示，在 H2O2存在情况下，可刺激 DC 细胞表面共刺激分子 CD80、CD86 表达[11].而在本研究中，我们对比了不加 VC（ 空白对照） 及不同浓度 VC 下 DC细胞表面二类共刺激分子标志 CD80、CD86 表达情况影响。结果显示，VC 可显着促进 DC 表面二类分子CD80、CD86 表达（ 图 2A、B） ,并呈现浓度依赖正相关性。同时本实验还显示，VC 对 DC 细胞 CD80/86 调节最佳浓度约为 1 mmol/L,作用时间约为 3 d,成熟度 CD80/86 可达（ 78. 6±4. 6） %（ 图2C） .

　　2. 3 VC 可刺激 APC 细胞表面 MHCⅡ分子 DR 表达在机体的抗肿瘤免疫反应中，细胞免疫发挥主要的效应。CD8+的细胞毒性 T 细胞（ CTL） 是有效抗肿瘤细胞免疫的核心[4],而这与 DC 息息相关。未成熟的DC 能通过内吞作用高效的捕捉抗原，胞内加工处理后与 MHCⅠ、MHCⅡ形成复合体，再提呈于 DC 表面，为激活抗原特异性的 T 淋巴细胞提供必需的第一信号[8-10].因此我们考察了 VC 对 DC 细胞表面 MHCⅡ类分子 DR 表达影响。结果显示，VC 可显着刺激MHCⅡ分子 DR 表达（ P<0. 05） （ 图 3A、B） ,并呈现 VC浓度依赖性及作用时间依赖性，当 VC 浓度达到 1mmol / L（ 处理 24 h） ,培养 3 d 后 DC 表达 MHCⅡ DR达到（ 56. 8±4. 4） %（ 图3B、C） .

　　2. 3 VC 可上调 DC 表面 CD40 表达 进而我们做了 CD40 及 CD154 表达情况，结果显示（ 图 4） ,DC细胞表面 CD40 表达随着 VC 作用浓度增加而呈现梯度依赖性，而 CD154 并没有显示此特性（ P<0. 05） ,说明 VC 促进 DC 细胞成熟可能通过上调CD40 表达进而刺激 B7-1 （ CD80 ） 、B7-2 （ CD86 ） 及MHCⅡ DR 表达。

　　2. 4 VC-DC 抗原捕获能力显着提升 将 1 mmol /L VC 培养 3 d 的 DC 与未加 VC 培养的 DC 抗原捕获能力相比较，利用 FITC 标记的 NY-ESO-1155-167与DC 细胞共孵育 2 h,洗涤两次后经荧光倒置显微镜观察，发现 VC-DC 其荧光强度显着高于未经 VC刺激的 DC（ 图 5A ~ D） （ 细胞浓度 106ml-1） .通过荧光灰度检测显示，VC-DC 捕获抗原能力显着高于未经刺激的 DC（ 图 5E） ,说明 VC 不仅可促进DC 细胞成熟，同时也可促进 DC 细胞的抗原捕获及提呈能力。
　　
　　3 讨论

　　维生素 C 是一种有效防止氧化损伤的抗氧化剂，可清除细胞内氧化自由基（ O2-）[4].生理范围下，维 生 素 C 在 血 清 中 含 量 一 般 在 70 ~100 μmol / L.研究显示，静脉注射 3 g 维生素 C,其受注者血清中 VC 的含量可达到 1 700 μmol/L,但是如果患者口服相同剂量，血液中 VC 含量仅达 220μmol/L[6].本实验证明在高浓度 VC（ 2. 5 mmol/L）影响下 DC 细胞依然可保持生理活性，较之生理浓度要显着高出很多，因此我们认为高剂量的 VC（ 如文中 1 mmol/L） 对于联合放化疗治疗癌症是一种途径。

　　据研究显示 VC 可作为一种抗肿瘤前体物质调控肿瘤细胞凋亡及抑制生长，大剂量的 VC（ 约 5mmol / L） 可引起肿瘤细胞的凋亡，当黑色素瘤细胞B16F10 暴露在 VC 中时[13,14],VC 可引起细胞色素C 释放进而引起线粒体酶减少。又有研究显示，VC可通过下调 CD71（ 转铁蛋白） 的表达进而降低细胞对金属离子（ 铁离子） 的摄入，后者被认为是维持肿瘤细胞活性的必要因素之一[15]; 而低剂量的 VC（ 小于 1 mmol/L） ,又可通过调节 Chk2-p53-p21Waf1/Cip1 途径以及影响细胞膜上受体生长因子，如胰岛素样生长因子（ IGF） -1 等来抑制肿瘤细胞增殖[16].且对于 VC 的抗肿瘤机制又有了新的发现，VC 可以通过抑制血管内皮生长因子（ VEGF） 的表达而抑制肿瘤血管生成[16].而另据 Chen 等[17]研究认为 VC抗肿瘤机制可能是 VC 会释放游离过氧化氢，直接作用于肿瘤细胞 DNA 干扰肿瘤细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡。但 VC 作为免疫调控物质的研究却鲜有报道。

　　CD80、CD86 是 DC 细胞表面共刺激分子，作为重要的第二信使可刺激 T 淋巴细胞发挥功能，因此CD80、CD86 的上调意味着 DC 功能的成熟[12].研究显示 CD80、CD86 受 CD40-CD40L 调控，并成正相关[9].本文证明 VC 可有效调控 DC 细胞成熟，当浓度为 1 mmol/L 时，对 DC 表面共刺激分子 CD80、CD86,MHCⅡ DR 及 CD40 表达有显着上调作用，很可能 VC 通过上调 CD40 的表达进而刺激 CD80、CD86 及 MHCⅡ表达，以增强 DC 抗原捕捉、提呈等功能。同时本研究证明 VC 处理最佳浓度为 1mmol / L 时，DC 最佳培养时间为 3 d,较之传统 DC培养方法7 d 显着缩短时间，可用于快速制备 DC 疫苗。

　　而另一方面，H2O2等氧化剂可显着上调 DC 细胞的分化程度，那么作为抗氧化剂的 VC 为何也能上调 DC 分化及活性？ 就 VC 而言，存在两种形式，还原态 （ 抗坏血酸） 及氧化态 （ 脱氢抗坏血酸，DHA） ,并且能在二者之间快速循环，这个过程中可能产生大量的游离 O2-自由基，进而上调 DC 活性。

　　但对于 VC 调控 DC 细胞的分子机制以及 VC 的免疫反应，特别是对 T 淋巴细胞的调控机制还需进一步详细的研究。