蛋白质与纳米金颗粒的相互作用分析

　　随着纳米科技的飞速发展，人们对纳米材料的研究也越来越深入。纳米材料由于其粒径大小的特异性，具有独特的物理及化学性质，例如大的比表面积、量子效应以及界面效应等（Zhu et al., 2012），使其在工业、科学技术及生物医学等领域均有广泛的关注及应用，现已经成为全世界各国发展最快的科学及技术开发领域之一。纳米金颗粒（AuNPs）是研究最早的纳米材料之一，也是研究的热点之一（Prashant etal., 2007）。AuNPs 除了具有良好的生物相容性、强的稳定性、高电子密度和催化作用等性质之外，还有许多独特和具有吸引力的特性：例如良好的导电性、尺寸依赖性、光学性、无毒等特点（Shi et al., 2012），这使得 AuNPs 在催化、医药和生物传感等方面展现了卓越的应用前景，也使得 AuNPs 成为了解纳米材料与蛋白质相互作用的自然起点（Everts et al., 2006）。近几年来，两亲性聚合物（AP）包裹的 AuNPs 得到了人们的广泛关注。由于 AP 包裹的 AuNPs 既可以在有机相也可以在水溶液中存在。这一特点拓宽了AuNPs 的研究领域。现在功能化的纳米颗粒已经在常见重大疾病如心脑血管疾病、癌症、糖尿病（陈尔飞等， 2014）的治疗中得到了应用。

　　蛋白质是具有非常复杂的多层次的三维构象，这种高度复杂的三维构象是使得蛋白质具有生物活性和免疫活性的重要保证。当蛋白质与纳米颗粒相互作用时，会在不同程度上来扰乱蛋白质的构象。相反，蛋白质与金颗粒相互作用时，由于蛋白质结合在金颗粒的表面，会对 AuNPs 的光学性质及其稳定性造成影响 （Gole et al., 2001），同时也可能会影响AuNPs 预先设计的功能。因此对于 AuNPs 与蛋白质相互作用机制的深入理解与研究，对高效利用功能化纳米颗粒在生物体内充分发挥作用理论基础。

　　牛血清蛋白（BSA）是研究得最为广泛的一种生物体内的蛋白。人们已经对 BSA 的氨基酸序列及其空间结构进行了透彻的分析。而且 BSA 在许多重要的生理功能中起着重要的作用，并且能够很容易的使其结构和构象发生改变。AP-AuNPs 与 BSA 的生物连接所形成的复合物（AuNPs-BSA）已作为细胞内的载体和显像剂得到广泛的应用（Jeyachandran et al.,2009）。因此，我们选用 BSA 为研究模型，来研究蛋白质与 AuNPs 的相互作用。

　　1 结果与分析
　　
　　1.1 BSA 与 AP-AuNPs 的物理吸附结果电泳检测
　　
　　蛋白质可以通过物理作用吸附在纳米颗粒表面。

　　从图 1 可以看出，从左至右，随着 BSA 浓度的增加，BSA 与 AP-AuNPs的吸附量也随之增多。通过与纯的AP-AuNPs 相比较我们认为，图中与 AP-AuNPs 在同一水平位置的条带为没有吸附上 BSA 的 AP-AuNPs,图中微滞后的条带为吸附上一条 BSA 的 AP-AuNPs.

　　选取吸附 1 个 BSA 的样品进行分析。

　　1.2 蛋白酶 K 酶切 AuNPs-BSA 的电泳检测结果
　　
　　本文中选取蛋白酶 K （proteinase K, ProK）对吸附在 AP-AuNPs 表面的 BSA 进行酶切。与 AP-AuN-Ps-BSA 相对比，随着 ProK 浓度的增加，AP-AuNPs-BSA 的迁移率逐渐的增大，但最终还是小于 AP-Au-NPs 的迁移率，说明吸附结合在 AP-AuNPs 表面的BSA 片段随着 ProK 浓度的增加而减少，但是还是有部分 BSA 的片段吸附在 AP-AuNPs 的表面，没有受到 ProK 的酶切（图 2）。

　　1.3 SDS 洗脱及吸附在 AP-AuNPs 表面肽段的 PAGE胶鉴定
　　
　　十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂。用 10%的 SDS 对 AP-AuNPs-BSA （酶）进行处理。

　　通过 2%的琼脂糖凝胶电泳我们看出，10%的 SDS 可以将吸附在 AP-AuNPs 表面的蛋白片段洗脱下来（图 3A）。然后将洗脱后的样品进行 SDS- 丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，来对洗脱下来的蛋白多肽片段进行鉴定。从图 3B 中我们可以看出，经过 SDS 洗脱的后的样品中，在分子量约 26 kD 处，有一条带出现，经与其它的样品比较，我们认为，该条带则为吸附在AP-AuNPs 表面的 BSA 片段。

　　2 讨论
　　
　　本实验选取 BSA 与 AP-AuNPs 通过简单的物理吸附作用结合在一起，通过琼脂糖凝胶电泳结果可以看出，BSA 可以稳定地吸附在 AP-AuNPs 的表面。

　　在经过蛋白酶 K 酶切的电泳结果可以推测，BSA 稳定的吸附在 AP-AuNPs 的表面是 BSA 中的一段氨基酸序列吸附在 AP-AuNPs 的表面所导致的。在经过 SDS 洗脱及 SDS-PAGE 电泳结果证明，BSA 与AP-AuNPs 是通过 BSA 的一段固定的多肽序列结合在 AP-AuNPs 所到导致的。该实验结果的发现，对于功能化的纳米颗粒在生物体内高效、稳定的应用奠定了坚实的基础。

　　3 材料与方法
　　
　　3.1 AP 合成
　　
　　AP合成的方法参照文献（Zhang et al., 2011）。简要概述：称取 3.084 g （15 mmol/L）的聚异丁烯马来酸酐置于 500 mL 的圆底烧瓶中，2.7 g（15 mmol/L）的十二胺干粉溶于 100 mL的四氢呋喃后与聚异丁烯马来酸酐混合，超声，使得溶液完全澄清。将混合液55~60℃加热、搅拌 1 h.用旋转蒸发仪将溶液浓缩到30~40mL后搅拌、过夜。次日，将溶液完全抽干，加入40 mL 的氯仿重新溶解。最终得到单元结构浓度（Cmononier）为 0.5mol/L的两性聚合物。

　　3.2 有机相 AuNPs 的合成
　　
　　合成方法参照文献（Lin et al., 2008）。简要描述：

　　称取 2.17 g 四辛基溴化铵溶于 80 mL 的甲苯中。称取 300 mg 氯金酸溶于 25 mL 的超纯水中。将两者混合至分液漏斗中，轻微震荡后弃水相，将有机相转移到圆底烧瓶中。称取 334 mg 硼氢化钠溶于 25 mL 的超纯水中，并迅速的加入到有机相中，搅拌 60 min 后转移到 250mL 的分液漏斗中，分别加入 NaCl、NaOH洗涤 3 次，弃水相后在转移到 250mL 的圆底烧瓶中，磁力搅拌，过夜。加入 10mL 十二烷硫醇，65℃水浴加热，搅拌 3h.分装在 40mL 的小瓶中，2000r/min 离心5min,收集上清。加入等体积的甲醇，2000r/min离心5min,弃上清，晾干，加入氯仿重新溶解。

　　3.3 AP 包裹 AuNPs
　　
　　包裹的方法参照文献（Zhang et al., 2011）。简要概述：根据每个 AuNP 的有效表面积每平方纳米含有 200 个 polymer 单元结构比例混合。每个 AuNP 的有效表面积的计算方法为：Aeff=4·仔·（deff·2-1）2,其中的 deff 为油相纳米金颗粒的有效动力学直径。由于 AuNP 和 polymer 的体积小，密度大，使得它们在溶液中分布比较密集。由于氯仿挥发的太快，在进行真空抽气时不能够将 polymer 均匀的包裹在 AuNP表面。在进行包裹时，先加入少量的氯仿有利于将polymer 均匀的包裹在 AuNP 表面，真空抽气直到将氯仿全部抽干。加入适量的 SB12 缓冲液进行搅拌，直到混合物完全溶解且澄清。这样就将油相的 AuNP转移至水相中（AP-AuNP）。

　　3.4 BSA 与 AP-AuNPs 的物理吸附实验
　　
　　取 PCR 管分别编号 1~10,按表 1 中比例加入AP-AuNPs 与 BSA 混匀，反应体系为 30滋L,不足由超纯水补齐。室温下反应 30 min.

　　3.5 经过酶切后 AP-AuNPs 表面肽段的回收
　　
　　将经过酶切后的样品用高效液相色谱法仪（HPLC）进行纯化，在紫外检测波长 520 nm 处将样品回收，用超滤管 4 000 r/min 离心，浓缩。将浓缩后的样品按照体积比 1:1 的比例加入 10%的 SDS,混合静置 1h.用 5%的浓缩胶、电压 20V/cm 电泳 70min,在用 15%的分离胶，电压为 60 V/cm 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的检测，电泳 100 min.由于水相纳米金颗粒（AP-AuNPs）太大以至于不能够进入到胶里，而肽链能够直接进入到胶里进行检测。