骨髓基质细胞的分离培养及其表面抗原测定与诱导分化

　　骨髓基质细胞(BMSCs)是干细胞及处于不同分化阶段的前体细胞的混合物，具有自我更新能力及多向分化潜能。由于取材方便、创伤小，用于细胞移植和基因治疗有许多优势，具有很好的临床应用前景。由于骨髓中细胞成分比较混杂，BMSCs 在骨髓中含量极少，仅占骨髓中有核细胞的 0． 001% ～0． 01%，实际应用中需对其进行体外分离纯化并大量扩增。2010 年12 月 ～2012 年5 月，我们对人BMSCs 进行分离培养，对培养细胞的表面抗原进行测定并诱导其向脂肪细胞、成骨细胞分化，为深入研究 BMSCs 的组织再生和修复提供实验基础。

　　1 材料与方法

　　1． 1 材料
　　主要试剂:α-MEM 培养基、胎牛血清(FCS)购自美国 GIBCO 公司，细胞表面抗原检测试剂 CD45、CD90、CD29、CD14、CD105抗体及其阴性对照抗体购自美国 BD 公司。主要设备:CO2恒温培养箱(BB16/BB5060 Heraeus，德国)，超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司)，倒置相差显微镜(Nikon 801808，日本)，正置显微镜( Nikon E600，日本)，LDZS-2 低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)，Caliber 流式细胞仪(美国 BD 公司)。

　　1． 2 方法

　　1． 2． 1 BMSCs
　　获得和培养 骨髓来源:1 例 24 岁男性颅脑外伤患者，无系统性疾病，术中用咬骨钳将损伤颅骨板障剪成 0． 5 cm 直径的小块，置于无菌器皿中。BMSCs 培养:在无菌条件下取出颅骨，放入直径 120 mm 的培养皿;用无血清 α-MEM 培养基冲洗骨松质，将骨髓冲出;反复吹打含有骨髓的冲洗液，用 150 目铜网过滤;滤液以 1 000 r/min 离心 5min，弃上清。用含 10% FCS 的 α-MEM 培养基重悬细胞，反复吹打制成单细胞悬液，接种于培养瓶中。

　　置于 37 ℃、5% 的 CO2恒温培养箱中培养，72 h 后更换新鲜培养基，去除未贴壁细胞并继续培养，每 3～ 4 d 更换新鲜培养基。待原代培养的细胞生长至80% 融合时，用 0． 25% 胰蛋白酶消化进行传代培养，取第 3 代以后的细胞用于实验。

　　1． 2． 2 体外培养
　　BMSCs 的形态学观察 采用倒置相差显微镜，逐日观察细胞生长情况和形态特征。

　　1． 2． 3 BMSCs
　　表面抗原检测 采用直接免疫荧光染色流式细胞术，测定 BMSCs 表面抗原 CD45、CD90、CD29、CD14、CD105。

　　1． 2． 4 诱导
　　BMSCs 向脂肪细胞分化 取对数生长期的 BMSCs，以 5 × 103/ cm2接种于 6 孔板中，每孔内置 2 个高压灭菌盖玻片。分别各取 2 个 6 孔板作为实验组，2 个 6 孔板作为对照组。48 h 后，实验组更换脂肪诱导培养基(1μmol/L 地塞米松、0． 5mmol / L IBMX、10 μg / mL 牛胰岛素、100 μmol / L 消炎痛、10% FCS 的 α-MEM) 进行脂肪细胞分化诱导，每隔 3 d 换液 1 次。对照组更换常规培养液。诱导 3 周后，分别取出盖玻片进行油红 O 染色。油红 O 染色方法:细胞爬片用 PBS 洗 3 次，10% 中性甲醛固定 10 min，PBS 洗 3 次，油红 O 染液中浸染20 min，PBS 洗4 次，Mayer 苏木素(1 000 r/min 离心5 min 去杂质，取上清，用于染色) 复染 8 min，PBS 洗4 次，湿片，封片，显微镜下观察。

　　1． 2． 5 诱导
　　BMSCs 向成骨细胞分化 取对数生长期的BMSCs 以5 ×103/ cm2接种于6 孔板中。分别各取 2 个 6 孔板作为实验组，2 个 6 孔板作为对照组。

　　48 h 后，实验组更换成骨诱导培养基(0． 1μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L 抗坏血酸磷酸盐、10% FCS 的 α-MEM)进行成骨细胞诱导，每隔3 d 换液 1 次。对照组更换常规培养液。诱导3 周后，取出盖玻片进行 von Kossa 染色。von Kossa染色方法:10% 中性甲醛固定 30 min，蒸馏水漂洗3 次;加入 1． 0% 硝酸银溶液，紫外线照射 1 h，蒸馏水漂洗3 次;加入5．0%硫代硫酸钠溶液浸泡 2 min，蒸馏水漂洗 3 次;1% 中性红复染 10 min，显微镜下观察。

　　2 结果

　　2． 1 体外培养
　　BMSCs 形态学观察 倒置相差显微镜下，刚接种的骨髓悬液中含有大量悬浮细胞，无细胞贴壁;72 h 后，发现少数细胞贴壁，呈梭形。细胞换液，将造血细胞弃去。贴壁细胞呈克隆性生长，细胞增殖后形态多样，呈异质性，以长梭形细胞为主，亦可见三角形、多角形及扁圆形细胞。6 ～8 d 后细胞形成集落。传代后，细胞形态趋于一致，呈长梭形，细胞排列紧密，可成漩涡状。见插页Ⅲ图 6。

　　2． 2 BMSCs
　　细胞表面抗原检测结果 流式细胞仪分析 BMSCs 表面抗原，表现为 CD45阴性、CD90阳性、CD29阳性、CD14阴性、CD105阳性。

　　2． 3 BMSCs
　　向脂肪细胞分化结果 实验组油红 O染色、苏木素复染核后，镜下观察可见胞质内脂滴为橙红色，胞核为蓝色。实验组 BMSCs 诱导后可见细胞内出现大小不等的脂肪滴，说明已被诱导为脂肪细胞;随着诱导时间延长，含脂滴细胞逐渐增多，胞内小脂滴逐渐聚集成大的脂滴，见插页Ⅲ图 7。对照组 BMSCs 油红 O 染色未见细胞内有脂肪颗粒。

　　2． 4 BMSCs
　　向成骨细胞分化结果 实验组成骨诱导后 BMSCs 变为多角形，细胞逐渐向多中心聚拢，形成钙结节;von Kossa 染色可见细胞间出现黑褐色致密圆形钙化结节，结节大小不均，周围有细胞聚集，诱导后细胞密度降低，见插页Ⅳ图 8。对照组仅少数细胞胞质内有浅褐色颗粒，未见钙化结节，且细胞密度很大。

　　3 讨论

　　BMSCs 是干细胞及处于不同分化阶段的前体细胞的混合物。20 世纪 70 年代，Friedenstein 等首先发现骨髓标本在培养过程中小部分贴壁细胞能分化形成类似骨、软骨的集落，并命名为 BMSCs。BM-SCs 也具有自我更新能力及多向分化潜能，在体外经诱导可以分化为骨、软骨、脂肪组织、神经组织及肝组织等。由于骨髓来源丰富，取材方便，创伤小，在组织再生和损伤修复中有很好的临床应用前景。

　　本实验中我们采用人骨髓组织，选择了密度梯度离心法及贴壁筛选法对 BMSCs 进行分离纯化及培养。倒置相差显微镜对所培养的细胞进行连续观察，发现刚接种的骨髓悬液中含有大量悬浮细胞，无细胞贴壁;72 h 后，发现少数细胞贴壁，呈梭形。细胞换液，将造血细胞弃去。贴壁细胞呈克隆性生长，细胞增殖后形态多样，呈异质性，以长梭形细胞为主，亦可见三角形、多角形及扁圆形细胞。6 ～ 8 d后细胞形成集落。传代后，细胞形态趋于一致，呈长梭形，细胞排列紧密，可成漩涡状，符合 BMSCs 的形态学特征。

　　为了进一步鉴定培养细胞为 BMSCs，本实验对其表面抗原 CD45、CD90、CD29、CD14、CD105进行检测，结果 CD90、CD29、CD105阳性，CD45、CD14阴性。一般认为，体外培养的间充质干细胞不表达分化相关的细胞标志，也不表达造血干细胞系的表面标志，如CD14、CD34以及白细胞分化抗原 CD45等，但表达sH2、SH3、CD90、CD44、CD29、CD71、CD106、CD120a、CD124和多种表面蛋白。因此，本实验培养细胞的免疫表型符合 BMSCs 的免疫表型。

　　BMSCs 具有多向分化潜能，在细胞移植和基因治疗方面有重要优势。研究表明，BMSCs 在体内可持续表达端粒酶活性，在体外可分化成骨、软骨和脂肪组织。克隆分析表明，部分 BMSCs 可在体内分化成新骨。Caspase-3、端粒酶对 BMSCs 的成骨分化起重要作用。本研究通过对实验组分别更换脂肪诱导培养基和成骨诱导培养基，诱导其分别向脂肪细胞、成骨细胞分化。诱导后，脂肪细胞分化组油红 O 染色可见细胞内出现大小不等的脂肪滴，说明已被诱导为脂肪细胞。随着诱导时间延长，含脂滴细胞逐渐增多，胞内小脂滴逐渐聚集成大的脂滴。向成骨细胞分化诱导后细胞变为多角形，逐渐向多中心聚拢，形成钙结节。von Kossa 染色可见细胞间出现黑褐色致密圆形钙化结节，结节大小不均，周围有细胞聚集，证明 BMSCs 已被诱导为成骨细胞。总之，本实验成功对 BMSCs 进行分离、纯化及培养，并诱导其向脂肪细胞、成骨细胞分化，为深入研究 BMSCs 的组织再生和修复提供了实验基础。

　　参考文献:

　　［1］李洪伟，郭开今，周冰，等． 人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性分析［J］． 山东医药，2011，51(26):91-93．
　　［2］范存刚，周景儒，张庆俊，等． 传代和冻存对胎肺间充质干细胞生长及分化的影响［J］． 山东医药，2013，53(44):1-3．