微环境诱导iPSC向神经元样细胞分化的能力,细胞生物学论文

　　诱导性多能干细胞（ induced pluripotent stemcells,iPSC）是利用基因工程技术将动物或人的体细胞重编程而得到的一种类似胚胎干细胞（embryonicstem cells,ESC）的多能干细胞类型[1].本研究小组前期研究发现，维甲酸能诱导 iPSC 分化成神经细胞，并且能形成功能性的神经元。但在体内特定微环境下，iPSC 是否可以有效分化为不同类型的神经元和胶质细胞还不清楚。活体内环境更为复杂，目前还没有 iPSC 移植治疗的成功案例，iPSC 能否在周围细胞和信号分子的作用下发生定向分化以及移植体内的细胞能否正常存活，尚不明确。

　　为明确 iPSC 在体内特定微环境诱导下定向分化的能力，本研究利用小鼠的脑组织匀浆上清与小鼠iPSC 共培养、小鼠海马脑片与小鼠 iPSC 共培养两种技术来模拟脑内微环境，同时与目前公认的比较成熟的化学诱导剂全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）的诱导效果相比较，研究特定微环境诱导 iPSC向神经元样细胞分化的能力。本研究将为后续 iPSC用于临床上神经损伤的治疗提供新的思路和方法，对再生医学的发展有一定意义。

　　1 材料和方法

　　1. 1 材料

　　小鼠 iPSC 购于中科院广州生物医药与健康研究院；MEM、knockout DMEM、神经元基础培养基 KSR、L-谷氨酰胺的衍生物 GlutaMAXTM、非必需氨基酸（ nonessential aminoacid,NEAA）、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）、B27、重组小鼠白血病抑制因子（ recombinant mouse leukemia inhibitoryfactor,rmLIF）均购自 Gibco 公司； ATRA 购自 Sigma 公司；马血清（horse serum,HS）、胎牛血清（fatal bovine serum,FBS）购自 HyClone 公司； RIPA 裂解液、ECL 发光试剂盒、HRP 标记的山羊抗兔 IgG 及 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 均购自碧云天生物技术公司；小鼠抗 GAPDH 单克隆抗体（monocalonalantibody,mAb）、兔抗 nestin 多克隆抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白（ glial fibrillary acidic protein,GFAP）多克隆抗体、小鼠抗微管相关蛋白 2（microtubule-associated protein 2,MAP2）mAb 购自 Abcam 公司； Alexa Fluor568 标记的山羊抗小鼠IgG、Alexa Flour 488 标记的山羊抗兔 IgG 购自 Moleularprobes 公司。CO2培养箱为 Thermo 公司产品。

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 iPSC 的培养与处理复苏小鼠 iPSC,并接种于经丝裂霉素 C 处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，加入iPSC 培养基（ knockout DMEM、 KSR、 100 × GlutaMAX、10 mmol / L NEAA、10 mmol / L β-mercaptoethanol、100 μg / LrmLIF）； 37℃ 、50 mL / L CO2培养箱中培养。待 iPSC 克隆长满饲养层（一般为 6 ~8 d），用 1 g/L 的胰蛋白酶消化成单细胞；将此 iPSC 与饲养层细胞混悬液转移至新的培养皿中，差速贴壁 30 min,以去除剩余的饲养层细胞，获得富集的 iPSC.

　　1. 2. 2 ATRA 诱导实验取 5 × 105/ mL 并清除饲养层细胞后的 iPSC,放置于低黏附的玻璃培养皿中悬浮培养。将不含rmLIF 的 iPSC 培养基作为该细胞的培养基，每天取出3 ~ 5 次，轻轻振荡使细胞团分开；每 2 d 半量换液，每天观察拟胚体（embryoid body,EB）形成的情况。EB 悬浮培养 4 d后，在原培养基中加入 ATRA （在培养基中的终浓度为5 × 10- 7mol / L）继续培养 3 ~ 4 d; 随后转入 1 g / L 明胶包被的 6 孔板中贴壁培养，培养基为不含 ATRA 的神经元基础培养基（ neurobasal medium、 50 × B27、 100 × GlutaMAX、100 IU / mL 青霉素、100 μg / mL 链霉素），并在培养基中加入20 ng / mL 的碱性成纤维细胞生长因子（ basic fibroblast growthfactor,bFGF）及 20 ng / mL 的表皮生长因子（ epidermal growthfactor,EGF）（100μL/孔）。每天观察其形态变化。

　　1. 2. 3 脑片微环境诱导 iPSC 向功能性神经元分化实验按文献[2]的方法进行脑片培养。简述如下：将 C57BL/6小鼠（P7）浸入 750 mL/L 乙醇中消毒、断头取脑，在预冷的Hank 平衡盐溶液中迅速剥离海马。将其水平置于 McIlwainTM自动切片机载物台上，切取 350 μm 厚海马切片；随后将切片转移至含培养膜（0. 14 μm）6 孔板进行培养。在马血清营养培养液（250 mL/L 马血清、250 mL/L Hank's 液、500 mL/LMEM、2 mmol / L 谷氨酰胺）条件下培养，每 3 d 换 1 次培养液。脑片培养 1 ~ 2 d,在培养的海马脑片上滴加已形成EB 的 iPSC 悬液，进行脑片-细胞共培养。观察在海马脑片微环境的诱导下，iPSC 的分化情况。

　　1. 2. 4 脑匀浆上清对小鼠 iPSC 向神经元样细胞分化的诱导实验小鼠脑组织匀浆上清的提取： 8 周龄小鼠断头取出脑组织，置于冰上，称取湿重，按 150 mg/mL 加入预冷的 knockoutDMEM 培养基，用匀浆器将脑组织匀浆，离心后吸取上清液，微孔滤膜过滤除菌后储存于 -20℃冰箱中备用；将 iPSC 形成EB,随后加入脑匀浆上清 100 μL/mL,细胞继续培养3 ~4 d,随后转入1 g/L 胶包被的6 孔板中贴壁培养，培养基为普通神经元培养基（neurobasal medium、50 × B27、100 × GlutaMAX、100 × P / S ），并在培养基中加入 20 ng / mL 的 bFGF 及20 ng / mL 的 EGF（100μL/每孔）。每天观察其形态变化。