探讨维甲酸诱导HAEC在体外分化为神经样细胞的最适浓度

　　目前，国内外研究多集中于干细胞向神经细胞分化的研究，而对体细胞的研究相对较少。干细胞存在伦理学、免疫排斥以及潜在的致瘤性等问题限制了其在临床上的应用，而具有部分胚胎干细胞特性的人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，HAEC)不存在上述问题，从而为细胞治疗提供了新的选择。

　　HAEC是一种来源于人胎盘羊膜组织的上皮层体细胞。研究显示HAEC具有部分胚胎干细胞特性，即在体外培养下具有向3个胚层分化的潜能：内胚层(胰腺细胞、肝细胞)、中胚层(心肌细胞)和外胚层(神经细胞、肌细胞、心肌细胞，骨细胞，脂肪细胞，胰腺细胞，肝细胞)。细胞生活的微环境在分子水平决定了细胞的分化方向，因此在维甲酸诱导体外培养的HAEC向神经样细胞分化的过程中，选择最佳维甲酸干预浓度是决定成功与否的关键。本实验通过细胞形态学分析和检测细胞内巢蛋白(nestin)、微管相关蛋白2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和转录因子Oct-4表达，探讨维甲酸诱导HAEC在体外分化为神经样细胞的最适浓度，为HAEC在细胞移植中的应用奠定基础。

　　材料与方法

　　材料与试剂 羊膜标本由复旦大学附属中山医院妇产科提供，本研究经产妇本人签署知情同意书，并经中山医院伦理委员会同意。DMEM/F12、特级胎牛血清、PBS缓冲液、青霉素-链霉素双抗溶液、0.25%胰蛋白酶+0.02EDTA (GibcoLtd，美国)。Ⅱ型胶原酶、Dnase 酶(Sigma Ltd，美国)。鼠抗人vimentin 单克隆抗体(SR0746，EpitomicsInc，美国)。鼠抗人CK-19抗体(BM0033)、兔抗人Nestin多抗(BA1289)、鼠抗人MAP-2多抗(BM1243)、兔抗人GFAP多抗(BA0056)(武汉博士德生物工程有限公司，中国)。兔抗人Oct-4多抗(MAB4305) (Millipore Ltd，美国)。100、200、300、400筛网(上海瑞谷生物科技有限公司，中国)。

　　羊膜组织提取和处理HIV、梅毒、乙肝等血清学反应阴性的足月剖宫产后胎盘，胎盘娩出后，无菌条件下2~4 h将羊膜与绒毛膜分离，并将羊膜置于DMEM/F12 培养液内保存。羊膜上皮细胞的原代培养应在羊膜取得后6 h内进行。

　　原代HAECs 培养将5 cm×5 cm大小的羊膜置于含有双抗(100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素)的PBS 中反复冲洗 3次。然后放入不加血清的DMEM/F12培养基中漂洗3次。将漂冼后的羊膜用眼科剪剪成数小块；再将组织块反复剪成1 mm×1 mm大小。取10 mL羊膜组织悬液，按1∶4比例加入0.25%的Ⅱ型胶原酶，并置于37℃恒温振荡孵箱内消化2 h后，1 000 r·min-1离心5 min，吸出上清液(含胶原酶消化液)。再加入等体积0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA室温下消化15 min，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。1 000r·min-1离心5 min，去上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基清洗后，将细胞悬液依次通过100、200、300、400 目筛网过滤，细胞计数，然后将细胞以 1 × 107个/mL 密度的 HAECs 悬液 2 mL 接种于 25 mL 培养瓶中，置5%CO2、37℃培养箱内培养。倒置显微镜动态观察细胞形态变化及生长增殖情况。3 d后首次换液，以后根据细胞生长情况，隔天换液，每次换液时去除非贴壁细胞。待3~4 d 后细胞融合长满时，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1∶2 或1∶3 比例进行传代，倒置显微镜观察，待细胞铺满瓶底时，重复上述操作。

　　原代HAECs的鉴定取第3代HAECs制作细胞爬片。常温下将细胞爬片用PBS漂洗3 min，×3次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3 min，×3次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入正常的山羊血清室温下封闭30 min，PBS漂洗3 min，×3次；加入鼠抗人CK19(1∶100)抗体和鼠抗人vimentin(1∶100)抗体，37℃孵育2 h，PBS漂洗3 min，×3次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育30min，PBS洗3min，×3次；DAB暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察并摄像。对照组用PBS代替一抗。

　　不同浓度维甲酸诱导HAECs向神经样细胞分化 消化收集第3 代HAECs 制成细胞爬片，待细胞生长至60%~70% 融合时(对照组用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基培养)，各维甲酸组去除培养基，加入含不同浓度维甲酸的DMEM/F12诱导液(内含10%胎牛血清)。

　　实验分组 共分为5组：①对照组，含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基处理，不含维甲酸；②1×10-8mol·L-1维甲酸组[含1×10-8mol·L-1维甲酸DMEM/F12培养基(含10％胎牛血清)]；③1×10-7mol·L-1维甲酸组[含1 × 10-7mol·L-1维甲酸DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清)]；④1×10-6mol·L-1维甲酸组[含1×10-6mol·L-1维甲酸的DMEM/F12培养基(含10% 胎牛血清)]；⑤1 ×10-5mol·L-1维甲酸组[含1×10-5mol·L-1维甲酸的DMEM/F12 培养基(含 10% 胎牛血清)]。每天换液，换液时去除非贴壁细胞，共诱导7 d。

　　不同浓度维甲酸诱导HAECs分化后Nestin免疫组化染色

　　取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片PBS漂洗3 min，×3次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3 min，× 3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 漂洗3 min，×3 次；加入正常的山羊血清，室温下封闭30 min，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入兔抗人 Nestin 抗体(1∶100)，37℃孵育2 h，PBS 漂洗3 min，×3 次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3 min，×3次；DAB暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，Nestin标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。

　　不同浓度维甲酸诱导HAECs分化后MAP-2免疫组化染色

　　取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片PBS漂洗3 min，×3次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3 min，× 3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS漂洗3 min，×3次；加入正常的山羊血清室温下封闭30 min，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入兔抗人 MAP-2抗体(1∶100)，37℃孵育2 h，PBS漂洗3 min，×3次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3 min，×3次；DAB暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，MAP-2标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。

　　不同浓度维甲酸诱导HAECs分化后GFAP免疫组化染色

　　取出细胞爬片。常温下，将细胞爬片PBS漂洗3 min，× 3 次；4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 漂洗 3min，× 3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 漂洗3 min，×3次；加入正常的山羊血清室温下封闭30 min，PBS漂洗3 min，×3次；加入兔抗人GFAP抗体(1∶100)，37℃孵育 2 h，PBS 漂洗 3 min，× 3 次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗3 min，×3 次；DAB 暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染 2min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，GFAP标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。

　　不同浓度维甲酸诱导HAECs分化过程中Oct-4免疫组化染色取出细胞爬片。常温下将细胞爬片PBS洗3min，×3次；4% 多聚甲醛固定10 min，PBS洗 3 min，×3 次；0.2%TritonX-100 破膜 20 min，PBS 洗 3 min，×3 次；加入正常的山羊血清室温下封闭 30 min，PBS 洗3 min，× 3 次；加入兔抗人 Oct-4 抗体(1∶100)，37℃孵育2h，PBS洗3 min，×3 次；加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育30 min，PBS 洗3 min，×3次；DAB暗环境下显色；自来水冲洗，苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察细胞并摄像，Oct-4标记的神经样阳性细胞呈棕褐色。

　　图像分析 随机取10 个不同视野(×100)，以每个视野内阳性细胞数为量化指标，每组视野阳性细胞数量作为该组HAECs 诱导分化为神经样阳性细胞密度代表值，以阳性细胞数/100倍视野表示。

　　统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件进行统计学分析。各组计量资料以 ±s表示。各组间比较采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

　　结 果

　　体外培养 HAECs 细胞的生长特性 倒置显微镜下观察细胞在贴壁前轮廓清晰、体积较小、圆形、透亮、折光性较强、富有立体感。接种2~3 d后贴壁，细胞逐渐变大，折光性降低，整个细胞轮廓变暗，完全伸展的细胞形态多样，呈梭形、多角形、眼睛样等，轮廓清晰，胞质丰富，胞核居中，可见1~2个核仁，呈圆形、卵圆形。

　　接种3 d后，人羊膜上皮细胞进入指数生长期，细胞数量明显增多，呈不规则多角形。接种5~7 d时90%细胞融合成片，形成单层放射状或漩涡状生长，开始进行传代。传代6 h 后即可贴壁，细胞3~4 d融合长满，形成单层放射状或漩涡状单层细胞。传至2~5代，细胞形态、大小、活性均匀一致。传至6代以后少数细胞形态发生变化，呈不规则形，细胞增殖减慢。传至第8代细胞胞质内出现空泡和黑色颗粒，细胞增殖能力减弱，逐渐停滞生长，凋亡并从瓶壁脱落。第3代细胞融合后数量恒定，符合实验要求，取第3代细胞作为实验对象。

　　体外培养细胞的来源鉴定 上皮细胞标记物CK19标记的贴壁细胞胞质内有大量棕褐色物质，胞核呈蓝紫色(图 1A)；间质细胞标记物波形蛋白(vimentin)标记的贴壁细胞胞质内仅有少量棕褐色物质，胞核呈蓝紫色(图1C)。

　

　　不同浓度维甲酸对HAECs分化作用的影响

　　1.不同浓度维甲酸组HAECs分化的形态学变化：对照组细胞形态未发生改变；1×10-8mol·L-1维甲酸组少数细胞形态有所改变，胞质回缩，胞体伸出轴突样长突起；1 × 10-7mol·L-1维甲酸组部分细胞形态发生改变，出现双极或多级细胞，少数细胞在突出末端出现分支；1×10-6mol·L-1维甲酸组出现较多双极或多级细胞，部分细胞出现突起并相互连接成网；1×10-5mol·L-1维甲酸组细胞胞质出现空泡或黑色颗粒状物，大量细胞固缩脱落。

　　2. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组HAECs诱导分化细胞的Nestin 阳性细胞(图2，3)表达率：对照组为(12.12±0.37)%，1×10-8mol·L-1维甲酸组为(15.13±0.28)%，1 × 10-7mol·L-1维甲酸组为(17.56±1.15)%，1 ×10-6mol·L-1维甲酸组为(20.98±0.95)%，1×10-5mol·L-1维甲酸组为(19.20±3.12)%。不同浓度维甲酸组与对照组比较，均差异有显著统计学意义(P<0.01)；不同浓度维甲酸组组间比较，除1×10-6mol·L-1维甲酸组、1×10-5mol·L-1维甲酸组外(P=0.15)，其他组均差异有显著统计学意义(P<0.01)。

　　3. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组HAECs诱导分化细胞的MAP-2 表达率(图2，3)：对照组为(14.12 ±1.04)%，1× 10-8mol·L-1维甲酸组为(22.81±1.32)%，1×10-7mol·L-1维甲酸组为(24.21±1.65)%，1×10-6mol·L-1维甲酸组为(29.56 ±1.35)%，1×10-5mol·L-1维甲酸组为(24.34±3.85)%。不同浓度维甲酸组与对照组比较，均差异有显著统计学意义(P<0.01)；不同浓度维甲酸组组间比较，除1×10-6mol·L-1维甲酸组、1×10-5mol·L-1维甲酸组外(P=0.23)，其他组均差异有显著统计学意义(P<0.01)。

　　4. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组HAECs诱导分化细胞的 GFAP 表达率(图2，3)：对照组为(11.23 ±0.26)%，1 × 10-8mol·L-1维甲酸组为(13.21±0.60)%，1×10-7mol·L-1维甲酸组为(15.63±1.18)%，1×10-6mol·L-1维甲酸组为(22.69±1.62)%，1×10-5mol·L-1维甲酸组为(15.79 ±3.31)%。不同浓度维甲酸组与对照组比较，均差异有显著统计学意义(P<0.01)；不同浓度维甲酸组组间比较，除1×10-6mol·L-1维甲酸组、1×10-5mol·L-1维甲酸组外(P=0.27)，其他组均差异有显著统计学意义(P<0.01)。

　

　　5. 免疫组化法检测不同浓度维甲酸组HAECs诱导分化细胞的 Oct-4 表达率(图 2，3)：对照组为(25.23 ±3.12)%，1× 10-8mol·L-1维甲酸组为(18.12±1.23)%，1×10-7mol·L-1维甲酸组为(12.65±0.52)%，1×10-6mol·L-1维甲酸组为(10.02±0.28)%，1×10-5mol·L-1维甲酸组为(9.65±2.03)%。不同浓度维甲酸组与对照组比较，均差异有显著统计学意义(P<0.01)；不同浓度维甲酸组组间比较，除1×10-6mol·L-1维甲酸组、1×10-5mol·L-1维甲酸组外(P=0.19)，其他组均差异有显著统计学意义(P<0.01)。

　　讨 论

　　HAECs为人体正常细胞，其能够在体外大量培养且被诱导分化为不同类型的细胞[5]，且HAECs还具有低免疫原性、不具致瘤性及无伦理法律问题等优点[4]，为治疗神经系统退行性疾病和外伤性神经损伤带来新的契机。但目前维甲酸诱导HAECs 分化的研究仍不十分完善，本研究拟探索不同浓度维甲酸对HAECs的诱导分化作用，从而确定其最适浓度，为HAECs在临床治疗神经系统疾病提供理论基础。

　　Takashima 等研究发现：新鲜分离的HAECs能够表达α抗胰蛋白酶、CPS-I、CYP2D6、CYP3A4等肝细胞功能基因及 HNF-3γ、HNF-4、C/EBP-α、HNF-1等转录因子，在加入1×10-7mol·L-1地塞米松和0.1 ?mol·L-1胰岛素诱导1周后，上述功能基因随诱导天数增加表达也逐渐增强。此外，还发现诱导后的HAECs能够合成并分泌白蛋白、储备糖原的功能，这正是肝细胞所具有的典型功能。

　　Miki等研究发现：HAECs加入10 mmol·L-1尼克酰胺悬浮培养14 d后，可检测到胰岛发育、胰岛功能基因，如胰腺十二指肠同源盒(PDX1)、神经源素3(Ngn3)、同源异形盒转录因子6(PDX6)、胰岛素、胰高血糖素的表达，且随着培养基中葡萄糖浓度的升高，胰岛素分泌也增加，证实HAECs可向胰腺样细胞分化。

　　Miki 等还发现：HAECs在加入1 mmol·L-1抗坏血酸磷酸盐培养14 d 后，可以检测到心肌特异性基因表达，如转录因子Nkx2.5和GATA-4及房、室肌球蛋白轻链2(MLC-2A，MLC-2V)。此外免疫组织化学染色检测到α-辅肌动蛋白和特异性结蛋白等肌系细胞标志物，证实HAECs体外诱导下也可表现出心肌细胞的特性。

　　多项研究发现[13~16]，HAECs表达神经元特异性标记物MAP-2、神经胶质标记物GFAP和神经干细胞标志物Nestin，在碱性成纤维生长因子、神经生长因子、表皮生长因子等多种生长因子和(或)维甲酸诱导下，能够上调Nestin、MAP-2和GFAP表达，具合成释放乙酰胆碱、儿茶酚胺、多巴胺及去甲肾上腺素等多种神经递质的功能，且能合成释放神经营养因子3、神经生长因子、脑源性神经营养因子等多种因子，证实人羊膜上皮细胞可向神经样细胞分化。

　　本研究采用免疫组化技术证实HAECs在维甲酸诱导下可导致Nestin、MAP-2、GFAP阳性细胞增多，Oct-4阳性细胞表达减少，促使HAECs 向神经样细胞分化；并将HAECs暴露于不同的维甲酸浓度下，根据神经样细胞的阳性比例寻求出维甲酸体外诱导HAECs向神经样细胞分化的最适浓度，结果表明维甲酸最适浓度为1 ×10-6mol·L-1。值得注意的是，在HAECs原代培养中，加入了1×10-5mol·L-1维甲酸诱导后细胞胞质内出现空泡样改变，大量细胞固缩脱落，并可见部分细胞碎片，提示维甲酸具有一定毒性，过高浓度的维甲酸可导致HAECs凋亡。

　　体外培养HAECs内上皮细胞特异性标记物CK19表达强阳性，证实培养细胞为上皮细胞，但部分细胞仍低表达vimentin，表明经过体外培养可能引起HAECs的去分化，也可能是羊膜组织上发生了上皮-间质转分化。总之，本研究显示HAECs可在维甲酸诱导下转化为神经样细胞，1×10-6mol·L-1维甲酸为最适诱导浓度，证实HAECs具有分化为神经细胞的潜能。本研究为临床上应用细胞治疗神经系统疾病提供新思路。