铬离子对成骨的毒性作用及对Tnfrsf17基因表达的作用

　　目前,临床上进行全髋关节置换术 (Total hiparthroplasty,THA) 所用金属假体主要为钴铬钼合金假体。当假体植入人体后,在机械磨擦与电化学腐蚀的作用下,长期使用会产生严重磨损,磨损产生大量的金属颗粒,释放大量金属离子,使得金属颗粒、离子在体内不断积聚。随后,积聚的金属离子可以引起假体周围的骨质溶解及假体的无菌性松动,这是大多数THA 失败的主要原因。有文献报道,假体置换术后病人血液和尿液中以及关节囊中金属离子浓度远远超过生理所需,从而对机体整体或局部产生一系列影响。Morais 等发现在体外培养中,铬和镍都可存留于骨髓细胞中。磨损颗粒可以刺激肉芽组织内的巨噬细胞、成纤维细胞、巨细胞以及破骨细胞。同时,磨损颗粒可以刺激炎性细胞因子和肽类因子的合成和释放增加,例如 TNF-α、(IL) -1β,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12p40,IL-11、巨噬细胞趋化蛋白-1 等,这些都参与骨质溶解和骨量的丢失。

　　Tnfrsf17,为 B 细胞表面分子,属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR) 家族,为Ⅰ型跨膜受体。Tnfrsf17 主要表达于成熟的 B 淋巴细胞,对于 B 细胞的成熟和自身免疫反应发挥重要作用。Tnfrsf17 特异性的结合肿瘤坏死因子家族成员13b(TNFSF13B / TALL-1 / BAFF) ,并激活 NF-kappaB 和MAPK8 / JNK 通路。除此之外,Tnfrsf17 还可以与各种TRAF 家族成员结合,借此可以为细胞生存和分化传导信号。但是,据此前文献报导,Tnfrsf17 和 BAFF-R只表达于 B 细胞表面。

　　因此,鉴于金属离子对机体的不良影响以及 Tnfrsf17具备的细胞生存和分化传导信号作用,本实验拟研究Cr3 +对成骨的毒性作用及对 Tnfrsf17 基因表达的影响。

　　1、 材料与方法

　　1. 1 溶液配制 溶液配制所需玻璃器皿使用前均经去离子水浸泡冲洗,烘干后盛制 Cr3 +溶液。所需 CrCl3·6H2O 粉末购于美国 Sigma 公司,准确称量并溶于去离子水内制成母液备用。依次稀释至目的浓度后使用火焰分光光度仪校正浓度。

　　1. 2 成骨细胞培养 SaO2成骨细胞购买于武汉博士德生物公司,培养于含体积分数 10% 的胎牛血清的Mccoy’5A 培养液,另外含 100 U / ml 的青霉素-链霉素。置于培养条件为 37 ℃、5%的 CO2孵箱中。每3 d换液 1 次,当瓶壁细胞丰度达 80%左右后用 0. 25% 的胰蛋白酶消化传代。

　　1. 3 Cr3 +对成骨细胞的干预浓度 胰蛋白酶消化传代 12 h 后,待细胞完全贴壁后换液,加入含 Cr3 +的细胞培养液,其浓度分别为 0. 1、1. 3 和 150 mg/L。

　　1. 4 细胞活性测定 96 孔板接种细胞,每孔 5 000 个细胞,每组设置 5 个复孔。Cr3 +溶液干预 24 h 后每孔加入 MTT (1 mg/ml) 50 μl,37 ℃孵育4 h,吸去孔内液体,加入 DMSO 液体150 μl/孔,振荡10 min,用酶标仪选择 490 nm 波长测定各孔吸光度(A) 值,其值与细胞数量成正比。

　　1. 5 细胞钙结节测定 细胞贴壁后使用含 Cr3 +的培养液培养细胞 7 d,每 3 d 换液 1 次。按照 Von Kossa试剂盒说明书进行钙结节染色,并于低倍光学显微镜下观察,每个象限随机取一个低倍视野,计算每孔 4 个视野计数之和。

　　1. 6 碱性磷酸酶活性测定 各浓度培养液干预成骨细胞后于相应时间节点终止培养。各瓶加 PBS 洗涤 3次,加入600 μl 0. 1% Tfiton X-100,于冰上用细胞挂刮除细胞,以使细胞膜破裂,离心,收集细胞裂解液,- 80 ℃ 冻存。用 BCA 试剂盒测定总蛋白浓度,碱性磷酸酶试剂盒测定 ALP 含量,最后计算相对的 ALP 活性。

　　1. 7 RT-PCR 法及普通电泳检测 Tnfrsf17 基因 mRNA的表达 Trizol 法提取细胞中 RNA,使用 TOYOBO 反转试剂盒反转合成 cDNA,以此为模版采用 PCR 扩增试剂盒进行目的基因的扩增。用 TOYOBO SYBRqPCR 试剂盒进行 Real Time PCR 扩增。 用 PrimerPremier 5. 0 软件设计引物,引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。反应总体积为 20. 0 μl,包括5 μlDNA 模 版,10 μl 的 Master Mix 缓 冲 液,0. 2 μl20 mmol / L的上下游引物,4. 6 μl ddH2O。采用 ABI7300 Real Time PCR 仪,按照机器说明书进行 40 循环(95 ℃ 15 s,60 ℃ 45 s) 。用 Light Cycler Software version3. 5 进行数据分析,基因的相对表达参照 2ΔΔCt法计算,以 GAPDH 作为内参照。电泳条带通过凝胶灰度值可以对 Tnfrsf17 基因 mRNA 的表达进行辅助分析。引物序列如下:

　　1. 8 Western 法检测 Tnfrsf17 基因蛋白产物的表达3 种浓度金属离子培养液干预成骨细胞后,于相应时间节点终止培养。各瓶加 PBS 洗涤 3 次,加入 600 μl蛋白裂解液(RIPA∶ PMSF = 100∶ 1) ,于冰上用细胞挂刮除细胞,以使细胞膜破裂,离心,收集收集上清,BCA法蛋白定量后调整蛋白浓度一致。取等量与 SDS 混匀后煮沸 5 min,然后经电泳、转膜、封闭、抗体孵育和发光等步骤后采用荧光化学发光凝胶成像分析系统检测蛋白表达,通过软件分析各组蛋白条带的灰度值并进行比较。

　　1. 9 统计学方法 采用 SPSS 18 统计软件进行分析,计量资料用 x珋 ± s 表示,组间比较用随机设计的两样本均数比较,随机区组比较采用方差分析及 LSD-q 法,以P < 0. 05 为差异有统计学意义。

　　2、 结果

　　2. 1 成骨细胞活性及钙结节结果 结果见图 1。Cr3 +与成骨细胞共培养 24 h 后,细胞 MTT 实验的 A 值明显下降。根据 A 值计算细胞成活率,与对照组相比,0. 1、1. 3 和 150 mg / L 组细胞成活率分别下降了 2. 45% 、7. 32% 和 22. 70% ,差异有统计学意义(P < 0. 05) 。与对照组相比,150 mg/L 组,Cr3 +对成骨细胞钙结节形成的影响较明显,差异有统计学意义(P <0. 05) 。

　　2. 2 Cr3 +溶液对成骨细胞 ALP 的影响 结果见图 2。

　　同一时间点相比,Cr3 +离子共培养成骨细胞的磷酸酶活性与对照组相比是有差别的(与对照组相比,P <0. 05) ; 对照组成骨细胞随着时间延长,其碱性磷酸酶活性也降低。对于同一浓度的金属离子共培养的成骨细胞细胞,随着时间的延长,其碱性磷酸酶的活性也逐渐降低。这可能是因为在体外成骨诱导条件下,成骨细胞完成增殖后,细胞 ALP 活性会逐渐增高,而当细胞进入矿化期时则表现出较低的 ALP 活性。有文献报导,ALP mRNA 在早期表达可增加 10 倍以上。

　　2. 3 RT-PCR 结果 从图 3 可以看出,Cr3 +干预成骨细胞成长后,0. 1、1. 3 和 150 mg/L 组各组与对照组相比,Tnfrsf17 的表达水平均有所下降,但是 3 种浓度之间比较,抑制作用没有差别,不具有统计学意义(P >0. 05) 。不同时间节点 PCR 结果显示金属离子对于Tnfrsf17 的表达自始至终发挥抑制作用,而且 24 h 组与 48 h 组、72h 组对基因表达的抑制作用有差别(P <0. 05) 。

　　2. 4 Tnfrsf17 蛋白表达结果 Cr3 +离子作用于成骨细胞后,由图 4 可知 Tnfrsf17 蛋白的表达水平有所降低。

　　24 h 后作用不明显; 48 h 时离子干预组 Tnfrsf17 蛋白表达开始下降,高浓度组结果较为明显; 72 h 时与48 h相比,Tnfrsf17 蛋白表达继续下降。同样,高浓度组蛋白表达抑制作用更加显著。将完成曝光的胶片放入扫描仪器中,选择 3 次曝光的重叠值得图 4。利用灰度值分析软件对该图进行数字分析,量化结果,并据此得图 5。

　　3、 讨论

　　THA 对于髋关节疾病具有缓解疼痛、改善关节功能、恢复肢体活动等优点,已成为治疗髋关节疾病的经典手术之一,在临床上得到了广泛的应用。而且,金属对金属大直径全髋置换和金属对金属髋关节表面置换以低脱位率、关节活动度大、稳定性高、磨损率低,尤其适合对活动量要求较高的年轻病人而受到广泛关注。

　　临床上最常用的假体金属为钴铬钼合金,其含钴量为50% ,含铬量 25%,这表明人工关节置换术后病人体内金属离子的蓄积主要以钴铬离子为主。Sauvé等对初次假体固定失败病人进行返修术,以金属对高分子聚乙烯假体代替初次使用的 MOM 假体,结果患者血清 Co2 +、Cr3 +浓度最后降至正常水平,表明金属离子几乎全部由 MOM 假体产生。虽然钴、铬等金属离子作为微量元素为人体生长发育所必须,但 THA后病人体内金属离子浓度远远超过生理所需。

　　假体松动是 THA 术后中晚期最主要的并发症之一。关节假体周围金属离子浓度的测定值目前尚未统一,但其浓度远高于外周血液金属离子浓度。金属关节界面假体植入人体后,可以在假体与骨面间形成一层界膜组织,界膜中含有大量活性细胞,高浓度的金属离子会对假体周围的这些活性细胞产生多种不良的生理影响,继而引起假体松动。成骨细胞在骨形成过程中起重要作用,一旦成骨细胞的成骨功能受到影响,这势必影响人工关节与骨面的整合,从而引起假体松动。

　　研究人员利用 SaO2成骨细胞,人为进行 Cr3 +离子干预,以此模拟假体周围成骨细胞的生存环境。在传代 12 h 后向培养液中添加 Cr3 +金属离子,作用于成骨细胞 24 h 后通过 MTT 法检测其活性,与此同时我们还通过显微镜观察细胞形态,发现正常培养 SaO2细胞形态为梯形,细胞体积较大,而 Cr3 +离子干预后的SaO2细胞差异有较大差别。浓度越高,对细胞影响越明显,细胞贴壁数目少且细胞体积小,伸展受限。通过MTT 法检测细胞活性发现 A 值基本与细胞数目成正比,细胞数目越多其 A 值越大,从而得到其细胞活性值越高。据此可知 Cr3 +离子对成骨细胞的形态及活性有较显著的影响。成骨细胞的主要功能是形成骨组织,因此,体外培养的成骨细胞形成骨组织中有机成分及矿化物质的能力是成骨细胞成骨能力的反应。实验结果显示与对照组相比,150 mg/L 组 Cr3 +离子对成骨细胞钙结节形成的影响较明显,差异有统计学意义。

　　而 0. 1 和 1. 3 mg/L 组可能由于误差的原因,结果显示Cr3 +离子对成骨细胞钙结节形成的影响较小,差异没有统计学意义。但是据国外文献报导,0. 1 mg/L等低浓度 Cr 离子对成骨细胞的骨化能力也具有较为明显的影响。另外,碱性磷酸酶活性作为成骨细胞成熟的重要标志,其在细胞中表达的多少,能合理地反映成骨细胞的分化程度和功能状态。由研究的实验结果可知,短期(12 h) 内,碱性磷酸酶的表达量较高,并且有明显的剂量效应; 随着时间的延长,长期(72 h) 则碱性磷酸酶的表达受到金属离子的影响,表达量下降,也呈现出剂量效应。

　　有研究指出钴铬等金属离子能通过氧化途径诱导滑膜细胞和骨髓巨噬细胞释放 IL-1β、IL-6 和 TNF-а,而这些细胞因此也间接参与了假体松动的过程。

　　其中 TNF-а 通过与其受体结合而发挥对成骨细胞的间接调控作用,然而 Tnfrsf17 为 TNF-а 通路受体之一,本研究发现 Cr3 +对 Tnfrsf17 的影响可能为 Cr3 +对成骨细胞发挥了直接调控作用。根据 PCR 结果可知,成骨细胞在 Cr3 +离子存在环境下,其 Tnfrsf17 基因的表达异常于正常情况,即表达下调。利用蛋白质印迹技术也可以表明成骨细胞在 Cr3 +离子的干预下,Tnfrsf17 基因的下游蛋白产物的表达量也受到影响。与正常对照组相比,表达量降低。

　　综上所述,本课题通过 Cr3 +离子对成骨细胞的毒性研究,以及对 Tnfrsf17 基因和蛋白表达的验证表明:Cr3 +离子对成骨细胞具有毒性作用,影响其增值及成骨活性,同时证明了 Tnfrsf17 表达于成骨细胞并且在Cr3 +的干预下其表达受到抑制。另外,本研究的不足之处是没有阐明 Cr3 +抑制 Tnfrsf17 基因表达后对成骨细胞生物学功能的影响,有待于进一步研究。

　　参考文献:
　　[1] 袁晓军,戴闽. 全髋关节置换术后金属离子对成骨细胞的生物学影响[J]. 国际骨科学杂志,2009,30(3) : 173-174.