miRNA在间充质干细胞成骨和成软骨分化中的作用

　　小分子RNA（microRNA,miRNA）是一类存在于真核生物体内，长约20~25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,对基因进行转录后调控，从而参与调节细胞增殖和分化，影响个体生长发育和疾病的发生过程，具有重要的生物学 功 能[1]. 间 充质干细胞 （mesenchymal stem cells,MSCs）是一类多能干细胞，具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，在机体的发育、衰退以及疾病中有着重要的作用。在不同的条件下，它可以分化成成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等不同的细胞系[2],因此它对于骨及软骨的发育重建、损伤修复和组织再生都有着重要的临床应用潜力。近年来，越来越多的研究表明miRNA与间充质干细胞的成骨和成软骨分化有着密切的关联。本文就miRNA在间充质干细胞成骨和成软骨分化中的作用做一综述。

　　1 miRNA的生成、特征及其功能

　　miRNA在细胞核内生成初级转录物；在核酸酶Drosha及其辅助因子的作用下，初级转录物被剪切成约70个核苷酸组成的miRNA前体，后者被转运至胞浆中。在细胞质中，miRNA前体由核酸酶Dicer剪切生成19.26个核苷酸且具有生物 学功 能 的成 熟miRNA[3].成熟的miRNA与RNA诱导沉默复合体（RNA.induced silencing complex,RISC）结合，进而识别靶基因，与靶mRNA的3′。非翻译区（untranslated region,UTR）碱基互补配对，发挥其降解mR.NA或抑制mRNA翻译的功能[4].miRNA具有明显的细胞特异性和组织特异性，在不同发育阶段的同一细胞或处于同一发育阶段的不同细胞中的miRNA表达谱不相同。

　　miRNA的数量约占整个基因组的1%,但能调节人类30%以上基因表达。一个miRNA可以结合到多个靶基因上发挥作用，且一个靶基因可受多个miRNA调控[5].研究表明：miRNA作为广泛存在的、对基因进行转录后调节的分子，在生物进程中发挥着重要的作用，包括早期发育、细胞分化、凋亡、器官的发育、病毒感染和癌症[6].

　　2 miRNA对成骨分化的调控

　　敲除Dicer和Drosha酶导致细胞内miRNA生成障碍后，MSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力丧失[7].而当敲除Dicer酶后，小鼠肢体发育障碍[8],从而提示适当水平的miRNA表达对于MSCs的成骨分化是必不可少的。近年来研究发现MSCs的成骨细胞分化是一个复杂的过程，涉及多种信号通路的调控。很多研究表明：miRNA是骨形成的重要调节因子，能够通过调节靶基因的mRNA,从而调节骨形成过程中各种信号因子的受体、转录因子和信号分子，达到对干细胞成骨分化的精确调控。通常，miRNA对基因进行负性调控，因此miRNA可能通过作用于促进成骨的基因从而抑制成骨，或作用于抑制成骨的基因从而促进成骨。

　　2.1 miRNA抑制间充质干细胞的成骨分化

　　细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）包括ERKl和ERK2,是将信号从表面受体传导至细胞核的关键因子。磷酸化激活的ERKl/2由细胞质转到细胞核内，进而介导下游因子的转录活化，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞凋亡等多种生物学反应。研究发现：当miRNA.138过表达时，MSCs的骨形成能力下降，而当miRNA.138被拮抗后，MSCs的骨形成能力增强。同时检测到局部粘着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）是miRNA.138的靶基因，miRNA.138通过抑制FAK的表达，从而抑制FAK.ERK1/2信号通路，最终抑制了MSCs的骨分化。[9].骨形成蛋白家族（bone morphogenetic protein,BMP）属于转化生长因子（transforming growth factor,TGF.β）超家族成员，BMPs与细胞膜上BMP受体结合后，导致受体激酶的激活，进而磷酸化细胞内的Smadl/5/8,后者与Smad4形成复合物后进入到细胞核内，结合在相应的DNA序列上，从而调节成骨细胞分化相关因子的表达。

　　Itoh等[10]发现：miRNA.141、miRNA.200a和miRNA.370能够显着下调BMP2诱导的MC3T3.E1细胞的分化，miRNA.141和。200a可能是通过抑制同源盒结构域基因Dlx5的翻译从而发挥作用，而miRNA.370可能 是通过抑制转录因 子Ets1的表达从而调节成骨分化。

　　Runt相关转录因子2（runt.related transcription factor2,Runx2）是成骨分化过程中重要的转录因子。成骨分化中的许多信号通路如TGF.β、Notch等，均能通过启动Runx2基因表达，最终激活成骨分化相关基因。Huang[11]等发现：诱导C2/C12、ST2以及间充质干细胞细胞系脂向分化时，miR.204上调，而Runx2的表达水平下降。抑制miR.204可上调Runx2水平的表达促进成骨分化，抑制成脂分化。

　　通过荧光酶基因系统，进一步证明miR.204通过靶向抑制Runx2mRNA的翻译，从而抑制干细胞的成骨分化。在C2C12细胞成骨分化中，miR.206随着分化的进行，其表达逐渐将降低。当miR.206过表达时，抑制成骨分化，而敲除miR.206则促进细胞的成骨分化。

　　miR.206的靶基因是连接蛋白43（connexin 43,Cx43），抑制miR.206可以上调Cx43的表达。但在成骨分化过程中，Runx2和Osterix等多种调节因子没有参与miR.206的调节[12].虽然研究表明甲状旁腺素（parathyroid hormone,PTH）可以调节Cx43,但未观察到PTH对miR.206的影响，表明miR.206不通过PTH调节通路调控细胞成骨分化。另有研究发现：在BMP.2干预C2C12细胞激活Smad1/4后，miR.206表达水平下降；而不影响pri.miR.206表达水平，表明BMP.2通过抑制pri.miR.206转变为成熟的miR.206,从而实现对干细胞分化的调节功能。

　　Wnt/β。catenin信号转导通路的激活对干细胞增殖及成骨细胞分化具有重要的调节作用。在人MSCs分化过程中，通过表达miR.335能抑制人MSCs增殖及其成骨能力。Wnt信号通路能上调miR.335表达，而干扰素。γ（in.terferon.γ，IFN.γ）下调miR.3351Runx2是miR.335的直接靶基因，前者是骨分化过程的重要调节因子。

　　miR.335对Runx2的负调控，抑制人MSCs骨向分化[13].2.2 miRNA促进干细胞成骨分化。

　　研究表明：miRNA通过调控Wnt信号通路中的关键信号蛋白，激活或抑制Wnt通路，从而参与干细胞成骨分化作用。Dkkopf.1（DKK1）是Wnt信号通路中重要调节因子，miR.335.5p和miR.29a通过抑制DKK1表达，使β。catenin在细胞质内积聚，从而激活Wnt信号通路，促进干细胞的成骨分化[14,15].在ST2细胞中，miR.2861通过作用于组蛋白脱乙酰基酶（Histone deacetylases,HDAC5），降低HDAC5对成骨特异性转录因子Runx2的降解作用，通过间接提高Runx2,促进成骨细胞的分化。
miR.3960与miR.2861位于同一基因座，也能够调节BMP2介导的ST2细胞骨向分化。

　　miR.3960的靶基因是Hoxa2（Runx2表达的抑制物），而 且Runx2的过表达诱导miR.2861和miR.3960的转录，因此认为Runx2与miR.2861和miR.3960存在一个独特的自我调节通路[16].脂肪干细胞能向骨组织和脂肪组织分化，miR.17.5p促进脂肪干细胞的成骨向分化，与miR.106平衡调节脂肪干细胞的成骨向和成脂向的分化[17].　　

　　3 miRNA对软骨分化的调控

　　3.1 miRNA促进成软骨向分化

　　Miyaki等通过对目标基因分析以及荧光素酶检测显示：HDAC4是miR.140的靶基因[18].miR.140通过作用HDAC4,消除了HDAC4对Runx2的抑制，促进了软骨向分化[19].

　　3.2 miRNA负调节成软骨向分化

　　在TGF.β3驱动的MSCs成软骨分化过程中，miR.145表达的下调能有效促进MSCs成软骨分化。

　　Sox9是miR.145的靶基因，miR.145促进成软骨向分化的调控机制是通过调节Sox9转录后水平的蛋白表达，抑制以Sox9为介导因子特异性的参与调控MSCs的成软骨分化过程，负性调节软骨细胞分化[20].　　

　　4微环境的改变时miRNA对骨分化的影响

　　研究发现：微环境变化使miRNA功能发生改变，导致疾病发生，且往往伴随着一些关键miRNA表达的变化。

　　4.1 miRNA在炎性环境中对骨分化的调节作用

　　炎性刺激物，如内毒素、肿瘤坏死因子。α（tumor necrosis factor.α，TNF.α），通过激活c.jun氨基末端激酶（c.jun N.ter.minal kinase,JNK）信号通路，抑制BMP.2诱导的成骨分化。TNF.α可以诱导miR.155的表达，抑制细胞因子信号抑制因子（Suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1）的表达，而SOCS1可以抑制TNF.α诱导的JNK通路。研究表明：在炎性环境下，miRNA.155通过抑制SOCS1的表达，负性调节成骨分化作用[21].Liu等发现牙周炎患者的牙周膜韧带干细胞（periodon.tal ligament stem cells,PDLSCs）的多向分化潜能明显低于健康人的PDLSCs,其原因在于miR.17水平的抑制，升高miR.17的水平可以部分逆转PDLSCs的分化潜能；而且炎症可以促进Smad泛素化调节因子1（Smad ubiquitin regula.tory factor one,Smurf1）的表达，后者是骨向分化重要的负调节因子；实验证实：在PDLSCs中Smurf1是miR.17的直接靶基因。过多的细胞因子、miR.17和Smurf1形成一个反馈调节环。炎症细胞因子直接激活Smurf1,下调miR.17,因此提高Smurf1介导的骨向分化因子的降解。

　　4.2伊班碱酸盐对成骨细胞

　　miRNAs表达谱的影响用伊班碱酸盐处理PDLSCs,改变其生长微环境，PDLSCs增殖能力显着加强，且促进成骨相关基因表达。伊班碱酸盐能够引起成骨相关miRNA表达改变，而miRNA通过调节相应成骨过程中不同靶基因的表达，进而调控成骨分化，使碱性磷酸酶、骨保护素、骨钙素和Runx2基因表达增强。

　　5展望

　　miRNA是所有的生物发育过程及疾病发生过程的重要调控因子，其对干细胞分化相关基因的靶向调控也是目前的研究热点。研究miRNA与骨形成的关系对于牙周病引起的牙槽骨缺失以及口腔种植的发展都有很重要的意义。但在口腔领域，对miRNA与骨形成之间的关系的研究处于起步阶段，还有很多问题有待解决：参与成骨分化调控的miR.NA的研究还仅局限于对单一miRNA功能的研究，几个或多个miRNA之间对于成骨分化和骨代谢的调控尚不清楚。

　　不同的微环境下如炎症环境、高糖环境，或随着微环境的变化，miRNA的成骨分化和骨代谢会发生何种变化以及其机制如何还有待研究。