国产胎盘间充质干细胞制剂溶血性探讨

   
    间充质干细胞（ mesenchymal stem cells,MSCs） 来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，不仅有较强的增殖潜能，还能分化成不同来源的细胞，如神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞及胰岛样细胞等，可作为理想的种子细胞，用于衰老和病变引起的组织器官的损伤修复。临床上间充质干细胞在治疗多种血液系统疾病、肝硬化、神经系统疾病和自身免疫性疾病等方面具有广泛的应用前景。国外已有多种间充质干细胞产品获批上市[1 ~2].近几年来我国已经加大了对干细胞研究支持力度。本实验评价国产胎盘间充质干细胞制剂是否可引起溶血和红细胞聚集，以便为其在临床上应用提供一定的科学依据。

　　材料与方法

　　1 材料

　　间充质干细胞 人胎盘间充质干细胞，胎盘来源于自愿捐献者。经产妇及其家人签署知情同意书。

　　动物 日本大耳白兔，雄性，1 只，普通级，体重2. 54 kg,购自北京隆安实验动物养殖中心。动物使用许可证号： SYXK（ 津） 2011 -0005.

　　试剂 胎盘间充质干细胞制剂顺昊细胞生物技术有限公司制备。RPMI - 1640 培养基、DMEM - F -12 培养基，均为美国 Hyclone 公司生产； 10% 胎牛血清，兰州百灵生物科技有限公司生产； 淋巴细胞分离液，天津市灏洋生物制品科技有限公司生产。

　　仪器 Facsealibur 流式细胞仪，美国 BD 公司产品； 5424 离心机，德国 Eppendorf 公司产品； Ckx22 显微镜，日本 Olympus 有限公司产品； Lxj - IIb 低速台式离心机，上海安亭科学仪器有限公司产品； VarioskanFlash 酶标仪，美国 Thermo 公司产品。

　　2 间充质干细胞的分离提取和扩增

　　提取分离： 无菌获取胎盘，立即浸入含 RPMI -1640 培养基、10% 胎牛血清及 1% 青 - 链霉素的组织保护液中，分离提取。剪取胎盘绒毛膜面 1 ~2 cm 厚的组织，剪成 1 mm ×1 mm ×1 mm 的碎块，用 PBS 漂洗至无色，用胶原酶 37 ℃水平摇床震荡 3 h,悬液用100 μm 细胞筛过滤，上清以 2000 r · min- 1离心 10min,弃上清，所得沉淀即为间充质干细胞。

　　扩增： 在沉淀细胞中，加入适量培养液混匀，转入T - 75培养瓶中，以 37 ℃ 、5% CO2培养箱中培养。细胞生长至 80% 时，进行胰酶消化传代。传代时，以0. 25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化 3 ~ 4 min,加血清终止消化； 以 1500 r·min- 1离心 5 min,弃消化液，加入细胞培养液，吹打混匀，收集细胞悬液，接种于细胞培养瓶，置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

　　3 间充质干细胞样品的制备

　　将间充质干细胞重悬于含有 1%人血白蛋白的复方 电 解 质 注 射 液 中，制 备 浓 度 为 5. 0 × 105cells·mL- 1.将含有 1% 人血白蛋白的复方电解质溶液作为空白对照。阴性对照为 0. 9% 氯化钠注射液。阳性对照为去离子水。

　　4 溶血实验操作[3]家兔麻醉后，经心脏取血 10 mL,用玻璃珠除去纤维蛋白，用 0. 9%氯化钠注射液反复清洗红细胞 3 次，至上清呈无色透明，弃上清，用 0. 9%氯化钠注射液稀释成 2%的红血球混悬液。

　　取试管24 支，均分为 2 组并进行编号，其中每组1 ~ 5管为间充质干细胞制剂管，第 6 ~ 10 管为空白对照管，第11 管为阴性对照管，第 12 管阳性对照管。第 2组试管为第1 组试管的复管。参照表1 进行加样。

　　用直接观察和酶标仪比色结合的方法，进行溶血实验。直接观察各管在 15,30,45 min 和 1,2,3 h 是否出现溶血和红细胞凝聚现象。酶标仪测定结果以光密度（ A） 表示，并计算各实验管溶血率。如果受试药试管中溶液的溶血率小于 5%,则表示无溶血。

    结 果

    1 直接观察

　　1. 1 第 1 组试管

　　阴性对照管（ 11 号） : 加样后15 ~45 min,管中液体呈鲜红色浑浊； 加样后 1 h,少量上清液无色澄明，下层液体呈鲜红色浑浊，少量红细胞沉于管底； 加样后 2 h,管底部逐渐出现深红色沉淀，顶部上清液无色澄清且逐渐增多。孵育3 h,自培养箱取出试管，振摇后，见管底沉淀均匀分散，无红细胞凝聚发生。以 2000 r·min- 1离心后，见试管底部有少量沉淀，上清液呈无色澄清。

　　直接观察所见，阴性对照管未发生溶血，见表1.

　　阳性对照管（ 12 号） : 自加样 15 min 至 3 h,管中液体呈澄明鲜红色，除管底部逐渐出现少量沉淀外，无其他明显变化。孵育 3 h,振摇，见管底沉淀均匀分散，无红细胞凝聚发生。离心后，见试管底部有少量沉淀，上清液呈澄明鲜红色。直接观察所见，阳性对照管发生了溶血，见表 1.

　　间充质干细胞制剂管（ 1 ~ 5 号） 和空白对照管（ 6 ~10 号） 的变化，与阴性对照组变化相同，即直接观察所见，均未发生溶血，见表 1.

　　1. 2 第 2 组试管（ 复管）

　　用肉眼对各管与第 1 组试管的直接观察发现，结果完全一致。

　　2 经酶标仪测得结果

　　测定结果见图 1.

　　由图 1 可见，间充质干细胞制剂及间充质干细胞制剂空白对照各管的溶血率均低于 5%.

　　讨 论

　　间充质干细胞具有多向分化潜能，能支持造血和促进造血干细胞植入，具有调节免疫等特点。临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤等多种难治性疾病，并且作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病[4 -5].与骨髓、外周血、脂肪及胚胎等来源的间充质干细胞相比，胎盘间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、病原微生物感染率和免疫排斥发生率较低、无致瘤性以及不涉及伦理限制问题等特点。与捐献骨髓或采集动员外周血相比，供者无痛苦，感染机会少，扩增能力强，具有更大的应用潜能[6 -7].本实验结果表明，胎盘间充质干细胞制剂体外无溶血和致红细胞聚集作用，提示胎盘间充质干细胞制剂在临床应用时产生溶血和致红细胞聚集的可能性很小。

　　参考文献：

　　[1] 丁志，杨松林 . 间充质干细胞生物学特性及其分化潜能[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2011,15: 147 -150.

　　[2] 李丽春，何治，李剑平 . 胎盘间充质干细胞的体外诱导分化[J].中国组织工程研究，2013,6: 1116 -1121.

　　[3] 国家食品药品监督管理总局指导原则课题研究组 . 药物刺激性、过敏 性 和 溶 血 性 研 究 技 术 指 导 原 则[EB/OL].

　　[4] 朱金海，陈燕凌 . 骨髓间充质干细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究[J]. 福建医科大学学报，2010,44: 45 -48.

　　[5] 李丽春，李剑平 . 基因转染间充质干细胞的临床治疗： 特点与问题[J]. 中国组织工程研究，2014,18: 2257 -2262.

　　[6] 朱少芳，付霞霏，胡红波 . 人胎盘间充质干细胞大鼠体内移植的初步免疫学研究[J]. 中国现代医生，2013,51: 5 -10.

　　[7] 穆晓红，徐林，赵子义，等 . 人胎盘与骨髓源性间充质干细胞体外培养及生物学特性对比[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2009,13: 3708 - 3712.