颗粒细胞在卵母细胞体外成熟过程中的作用

　　卵母细胞体外成熟（IVM）是指将不成熟的卵母细胞，在体外模拟体内成熟的微环境，培养至成熟卵子（MⅡ）的过程。此项技术开始于动物实验，早在1935年Pincus发现兔子的不成熟卵可以在体外成熟，并且这个成熟过程是自发的。

　　30年后，Edwars提出人类的不成熟卵母细胞可以体外发育成熟，并且通过实验证实其成熟过程需要至少24h.在卵母细胞的成熟过程中颗粒细胞通过缝隙连接传递多种信号，参与卵母细胞减数分裂的启动以及卵胞浆的成熟。有研究表明，对颗粒细胞卵母细胞复 合体（Cumulus-oocyte comeplexes,COCs）行IVM时，体外成熟率与受精率显着提高[1].不过，也有试验证明，颗粒细胞存在与否，并不能影响IVM的结局，甚至对卵母细胞的成熟与受精有负面影响[2].本文以颗粒细胞与卵母细胞的联系及信号传递为切入点，探讨在不同培养条件下的DOs能 否 达 到 和COCs相近的效果，更深层次研究颗粒细胞在IVM过程中的影响及作用，从而为DOs体外成熟创造更适合的培养环境。

　　1资料与方法

　　1.1实验动物

　　8~12周龄体重>25g健康CD-1小鼠（雌性40只，雄性10只）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养在控温控湿及人工光照的条件下，自由饮水、采食。

　　1.2 IVM培养基IVM基础培养
　　
　　液购自瑞典vitrolife公司的卵裂期培养液（G1）；促卵泡生成素由瑞士Serono公司生产，剂量为75IU/支；HCG由瑞士Serono公司生产，剂量 为5 000IU/支。将 上 述 试 剂 配 置 成 含FSH75IU/L和HCG150IU/L的IVM培养液[3],并用配好的培养液制备四孔皿，每孔放0.5~0.8ml覆盖矿物油，放在37℃、CO2浓度为6%培养箱中温浴不少于6h备用。

　　1.3卵母细胞收集

　　雌鼠腹腔注射HMG10IU,48h后颈椎脱臼处死并取出卵巢。清除卵巢表面的结缔组织置 于MOPS工作液中反复清洗。用1ml注射器穿刺卵巢表面，收集COCs.

　　1.4雄鼠精子收集选取8~12周、体重>25g健康活跃的雄性小鼠，脱臼处死，打开腹腔用拉细的玻璃管刺破附睾，将获取的精子移入到预先平衡好的G-IVF中，培养2h以上备用。

　　1.5卵母细胞体外培养

　　培养箱设定温度37℃，CO2浓度6%.卵母细胞培养24h后，观察成熟度，排出第一极体的视为成熟卵[4],实施单精子显微注射技术（intracytoplasmicsperm injection,ICSI），受精后移入卵裂期培养液（G1）继续培养观察。

　　1.6观察指标

　　培养24h后观察卵母细胞成熟度。胞浆均匀清晰，有第一极体（first polar body,PB1）排出的卵为成熟卵（MⅡ期卵）。没有PB1排出，也没有生发泡（germinal vesicle,GV）的为MⅠ期卵。胞浆颗粒较粗，颜色较深，有一个完整的细胞核，核膜清晰，核仁单个折光明显，此为GV期卵。

　　ICSI后16~18h出现双原核视为受精。胚胎评级依据卵裂球的大小、形态、发育速率，胞浆均匀情况及无核碎片的量，分为4个等级：分为4个等级：

　　1级：卵裂球大小均匀、形态规则，透明带完整；胞质均匀清晰；胚胎内无核碎片<10%.2级：卵裂球大小略不均匀、形态略不规则；胞质可有颗粒现象；胚胎内碎片10%~20%.

　　3级：卵裂球大小明显不均匀、可有明显形态不规则；胞质可有明显颗粒现象；胚胎内碎片21%~50%.4级：卵裂球大小严重不均匀；胞质可有严重颗粒现象；胚胎内碎片>50%.培养至第三天，卵裂球数目≥7且评级≥2级为优质胚胎。

　　1.7统计学方法应用SPSS 11.0软件包进行统计学分析，计量资料用单向方差分析（One-Way ANOVA），计数资料采用χ2检验。检验水准α=0.05.

　　2结果
　　
　　2.1三组卵母细胞成熟率的比较三组成熟率比较差异无统计学意义 （P >0.05）。但A、B二组的成熟率略高。见表1.

　　2.2三组卵母细胞受精率及后续发育比较A、B二组相对于C组有较高的受精率和优质胚胎率，差异有统计学意义（P<0.05），A、B二组之间的差异无统计学意义（P<0.05）。见表2.

　　3讨论

　　哺乳动物的卵母细胞表面包绕着多层排列紧密的颗粒细胞，它们与卵母细胞存在广泛而复杂的联系，在卵母细胞生长发育及成熟分裂过程中起着非常重要的作用。通过电镜观察，卵母细胞的细胞膜（卵黄膜）有许多微绒毛突向透明带，与外层的颗粒细胞形成联系。通过这些结构，颗粒细胞可以向卵母细胞提供营养物质、传递信号，这是多种激素、因子作用于卵母细胞的媒介[5]:

　　①促性腺激素作用于颗粒细胞，调节cAMP的合成及传递，调节卵母细胞成熟的进程。

　　②颗粒细胞在促性腺激素的作用下分泌甾体激素，体外培养中在有甾体激素的存在下卵母细胞后期发育更好，这可能与胞浆更成熟有关。

　　③颗粒细胞中cAMP依赖的MAPK通路激活是卵母细胞核成熟所必要的。

　　④颗粒细胞合成的激活素和抑制素能调节促性腺激素特别是FSH的分泌，在卵母细胞成熟中发挥重要作用。体外培养过程中，低浓度的颗粒细胞可以促进卵母细胞成熟分裂，高浓度的颗粒细胞作用则相反。这可能因为，更多的颗粒细胞能合成更多的cAMP,导致 卵母细 胞内cAMP升高，抑制减数分裂的重启。所以，有学者主张培养液中加入颗粒细胞，用以延缓核成熟，从而让胞浆与胞核成熟更加同步。

　　大量数据证明颗粒细胞能促进卵母细胞胞浆的成熟[6],脱去颗粒的未成熟卵母细胞即使发育成熟，也不能正常受精及发育[7].卵母细胞在体外的培养环境与体内不同，在处理卵母细胞和脱颗粒的过程中，丢失了卵泡膜细胞、卵丘细胞和卵泡液，这会导致减数分裂抑制因子尤其是cAMP的合成减少，又由于卵泡液中抑制成分丢失，失去了抑制成分的卵母细胞可以激发减数分裂，核成熟的进程不被控制。

　　由此可见，离体的未成熟卵母细胞可自发的核成熟，这可能是一个自动程序。尽管卵母细胞的生长依赖于颗粒细胞，但在成熟分裂的过程中颗粒细胞不被依赖。本次实验证实DOs与COCs有相近的成熟率。卵母细胞表明没有促性腺激素的受体，失去了激素及颗粒细胞的作用DOs的胞浆很难成熟，而细胞核成熟仍可自发进行。
　　
　　此时的卵母细胞胞浆与胞核发育极不同步，导致了受精率低下、多精受精、发育潜能差等诸多问题，严重影响成功率。因此我们需要采取措施来延缓核成熟的进程及促进卵胞浆的成熟：将DOs与COCs混合培养，希望颗粒细胞合成的cAMP、雌孕激素以及自分泌和旁分泌的活性因子能对DOs产生影响。本次试验显示，单独培养的DOs虽有不错的成熟率，但其成熟后的胚胎发育不佳。这是因为缺乏了颗粒细胞对卵母细胞成熟的调控，卵胞浆和细胞核成熟很难同步，出现了胞浆不成熟但细胞核却率先成熟的卵子。同时本此试验也证实与COCs混合培养的DOs与单独培养的COCs有相近的成熟率及发育潜能。这可能因为COCs体外培养中，在Gn的作用下颗粒细胞自分泌和旁分泌的活性物质可以影响临近的DOs[8],并且裸卵仍有颗粒细胞埋入透明带的部分，用来传递各种信号[91.

　　这些信号调控了卵母细胞的成熟，使胞浆与胞核发育更加同步。

　　4参考文献：
　　[1]人未成熟卵母细胞培养体系研究进展[J].生殖与避孕，2014,（5）：388-394.
　　[2]Takashi Nauai,Nobuhiko Yamauchi,Kazuhiro Kiku-chi.Nuclear and cytoplasmic maturation in vitro ofporcine oocytes[J].Journal of Reproduction and De-velopment,2001,147:55-61.
　　[3]洪焱，黄绘，骆荣，等.培养液中添加不同促性腺激素对卵母细胞体外成熟的影响[J].生殖与避孕，2011,31（12）:833-837.