视网膜血管铺片技术的优化创新

　　视网膜是由大脑向外延伸的视觉神经末梢组织，其结构复杂、精细、脆弱而代谢旺盛。其血管属于终末血管系统，任何病理性的破坏和血管梗阻等引起的组织缺氧，均能导致组织坏死，使其丧失感受和传导光刺激的功能。因此血管改变是视网膜病变的重要特点。视网膜血管铺片是研究视网膜血管病变的重要技术。但这项技术的消化时间不宜掌握，展片难度大，很难制备出理想的视网膜血管铺片。国内外学者多采用胰蛋白酶直接消化或胃蛋白酶 - 胰蛋白酶联合消化制备视网膜血管铺片。在本研究中，我们总结前人经验，不断摸索改进，建立了新的视网膜血管铺片技术，现总结如下。

　　1 材料和方法

　　1. 1 材料

　　BALB / c 小鼠来源于军事医学科学院实验动物中心【SCXK（ 军） 2012 -0004】，SD 大鼠购自中国食品药品检定研究院实验动物资源研究中心【SCXK（ 京） 2012 -0001】，SYXK（ 京） 2013 -0019.犬购自北京日新科技有限公司【SCXK（ 京） 2011 - 0007】，恒河猴由中国医学科学院医学实验动物研究所提供【SCXK （ 京） 2014 - 0011】，SYXK （ 京） 2010 -0030.苏木素及伊红 Y 染色液均为国产试剂（ 益利精 细 ） ,高 碘 酸 （ 批 号 011108,北 京 ） ,Schiff（ UFG0108,上海） ,Proteinase K （ CALBIOCHEM,cat # 539480 ） ,Trypsin 1: 250 Porcine Pancreas（ AMRESCO,lot #2861C173） ,anti-CD31 antibody（ ABCAM,ab28364） ,anti-VEGF antibody（ BOSTER,cat#BA0407 ） ,兔 超敏二步法免疫组化检测试剂（ 中杉金桥，PV - 9001） .正常羊血清工作液（ 中杉金桥，ZLI - 9056） ,抗体稀释液（ 中杉金桥，ZLI -9030） .

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 大鼠视网膜血管铺片的制备

　　大鼠脱颈椎法处死，摘取眼球，固定于 10% 中性福尔马林。

　　沿距齿缘剪开眼球去除晶状体，用蒸馏水漂洗，以视神经乳头为中心将眼球壁均匀地剪成 4 份，剥离眼球壁视网膜层，再用蒸馏水漂洗。

　　将剥离出的视网膜放在蒸馏水中 37℃孵育 1 ~2 h,蒸馏水漂洗，孵育后的视网膜放入 1 g / L 的蛋白酶 K 中，56℃消化 13 ~17min,去除消化掉的感光层细胞，蒸馏水漂洗，再将视网膜层放入 3% 胰蛋白酶消化液中，37℃消化 40 ~60 min.

　　用吸管将半透明状的血管网移入蒸馏水中漂洗，用吸管轻轻吹打非透明状区域，直到血管网成透明状，再将吹打成透明状的血管网铺到含多聚赖氨酸的载玻片上，展平，自然干燥。

　　在消化过程中，蛋白酶 k 消化时，每 5 min 轻柔摇动一次，再以最低完成消化时间为观察起点： 蛋白酶 K 消化 13 min 时，肉眼观察，轻柔摇动，若见感光层细胞脱落，即完成第一步消化。若消化不完全，每 2 min 轻柔摇动观察一次，直至感光层脱落。

　　胰蛋白酶消化时，每 10 min 轻柔摇动一次，也是以最低完成消化时间为观察起点，若消化不完全，每5min 轻柔摇动观察一次。

　　1. 2. 2 不同动物的视网膜在消化酶中的消化时间

　　在大鼠铺片基础上，我们摸索了 BALB/c 小鼠，犬和恒河猴视网膜血管铺片的消化时间表 1.

　　BALB / c 小鼠眼球小，在剥取视网膜层之前，要将眼球壁均匀剪成 2 份。犬和恒河猴眼球较大，结构特殊，取材后需立即固定 4h,再用锋利的刀片在眼球的上下部各切开一个小口，继续固定 24h.将眼球壁均匀地剪成若干等份，每一等份大小约 0. 4 cm ×0. 4 cm,再剥离视网膜层。

　　1. 2. 3 视网膜血管铺片 HE 染色

　　将视网膜血管铺片置于自来水中水化 15 min,苏木苏染核 1 min,自来水冲洗，伊红复染 2 min,梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

　　1. 2. 4 视网膜血管铺片 PAS 染色

　　PAS 染色方法参照文献[1]: 将视网膜血管铺片置于自来水中水化 15 min,蒸馏水洗 2 次，加入高碘酸氧化 10 min,蒸馏水速洗 2 次，加入 schiff 试剂反应5 min,自来水流水冲洗2 min,苏木素染核2 min,自来水返蓝5 min,梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

　　1. 2. 5 视网膜血管铺片免疫组化染色

    免疫组化染色方法参照文献[2],略有改变： ①将视网膜血管铺片置于 PBS 中水化 15 min; ②微波中火修复5 min; ③3%双氧水封闭15 min; ④正常羊血清工作液封闭 20 min; ⑤滴加用抗体稀释液稀释的一抗 （ CD31 稀释度为 1 ∶ 50; VEGF 稀释度为1∶ 200） ,室温孵育 1. 5 h; ⑥滴加二抗试剂 1,室温孵育 10 min; ⑦滴加二抗试剂 2,室温孵育 10 min; ⑧DAB 显色； ⑨苏木素复染 4 s; ⑩梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片2 结果。

　　2. 1 大鼠视网膜血管铺片

　　经 HE 及 PAS 染色可见： 铺片完整，清晰显示血管走向。各级血管形态清晰，血管分支清楚完整，无断裂现象。细胞形态清晰，细胞核可清晰显示（ 彩插 12 图 1） .

　　酶消化会造成部分抗原的丢失，因此需要对抗原进行修复。修复温度太低造成修复不完全，温度太高又会脱片。经过摸索，我们发现，微波中火5min 即可将抗原修复。免疫组化结果显示： CD31和血管内皮生长因子 （ vascular endothelial growthfactor,VEGF） 在正常大鼠铺片均有表达： CD31 在血管周细胞及内皮细胞均有表达； VEGF 主要在内皮细胞表达。

　　2. 2 小鼠、狗、猴视网膜铺片

　　根据大鼠铺片经验，我们摸索了 BALB/c 小鼠，犬和恒河猴的视网膜血管铺片消化时间。经 HE 及PAS 染色，可见血管网完整，无神经组织残留。各级血管结构清楚，大动物小动脉可显示血管壁的平滑肌。毛细血管网由内皮细胞和周细胞组成，细胞形态清晰，细胞核结构清楚（ 彩插 12 图 2） .

　　3 讨论

　　1960 年 Kuwabara[3]用胰蛋白酶对视网膜进行消化制备了视网膜血管铺片，为视网膜血管的研究提供了一种新的手段。1963 年 Ashton[4]改进了Kuwabara 的方法，用胃蛋白酶 - 胰蛋白酶联合消化法，成功制备了猫的视网膜血管铺片。此后又经过各国学者的不断努力[5 -8],才有了今天的技术基础。

　　视网膜血管消化铺片技术难度较大： 消化不完全，铺片不能充分显示出血管。消化过度，又会造成血管结构不清晰，甚至断裂，直接影响对实验结果的观察和分析。蛋白酶 K 是一种高活性蛋白酶，能快速、有效地裂解组织细胞，因此在本研究中，我们选择先用蛋白酶 K 消化掉视网膜感光层细胞。

　　同时，蛋白酶 K 能穿透细胞膜，破坏细胞核，于是我们将视网膜层漂洗后再移入到 3% 胰蛋白酶中进一步消化。应用蛋白酶 K - 胰蛋白酶联合消化法，成功制备了不同实验动物的视网膜血管铺片。

　　视网膜血管铺片制备过程中，应注意以下几点： ①眼球的固定： 大、小鼠眼球取材后直接固定于10% 中性福尔马林 24 h 以上。狗和猴眼球组织结构特殊，各部分组织结构的软硬度不同，因此取材后立即固定4 h,再用锋利的刀片在眼球的上下部各切开一个小口，继续固定 24 h.由于固定液易造成视网膜血管的断裂，因此固定时间最好不超过72 h.②视网膜的剥离： 视网膜位于眼球壁的内层，组织比较薄，而且附着在色素层上，剥离过程中很容易破碎。因此去除晶状体后，以视神经乳头为中心，将眼球壁剪开成若干等份，轻轻剥离出视网膜。③血管的消化： 消化过程中，随时注意观察。蛋白酶 K消化能力极强，每 5 min 轻微摇动一次，再以最低完成消化时间为观察起点，每 2 min 轻柔摇动一次，待肉眼可见感光层脱落即可终止消化。换成胰蛋白酶消化时，每 10 min 轻微摇动一次，再以最低完成消化时间为观察起点，每 5 min 轻柔摇动一次，待可见半透明血管网即终止消化。④铺片： 将消化好的血管网漂洗干净，平铺于含多聚赖氨酸的载玻片上，不要将载玻片上的水吸干净，否则未贴壁的血管网漂移，影响对血管走向的观察。⑤抗原修复：常规微波修复石蜡切片需要高火3 min,中火5 min,再低火 3 min.而视网膜血管铺片只需中火 5 min即可完成抗原修复。

　　蛋白酶 K-胰蛋白酶联合消化法制备大鼠视网膜血管铺片成功率高，稳定性好，同时也适用于不同实验动物，为视网膜血管性疾病的研究提供了重要途径。

　　参考文献：

　　[1] 李彦红，朱华，徐艳峰，等。 过敏性紫癜兔模型的免疫学改变及机制初探[J]. 中国实验动物学报。 2013,21（ 6） : 65 -69.

　　[2] 朱华，徐艳峰，刘颖，等。 链脲佐菌素诱导糖尿病恒河猴胰岛细胞数量的变化[J]. 中国比较医学杂志。 2012,22（ 12） : 1- 3.

　　[3] Kuwabara T,Cogan DG. Studies of retinal vascular patterns. I.Normal architecture [J]. Arch Ophthalmol. 1960,64 （ 6） : 904- 911.

　　[4] Ashton N. Studies of the retinal capillaries in relation to diabeticand other retinopathies [J]. Brit J Ophthal. 1963,47（ 9） : 521- 538.