热带果树基因分离与克隆技术的应用与总结,基因工程论文

克隆技术论文第六篇：热带果树基因分离与克隆技术的应用与总结

　　摘要：以常见的几种热带水果（香蕉、番木瓜、芒果、菠萝和荔枝等）为例，总结了近年来利用常见的技术手段如c DNA末端快速克隆技术（repid-amplification of c DNA ends,RACE）和实时逆转录聚合酶链式反应技术（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）等方式进行基因分离，并将成功克隆出的目的基因或片段进行基因分析与表达研究，最后阐述了基因分离与克隆技术的优势与缺陷，对基因分离及克隆技术提出了展望，旨为今后科研人员进行进一步的基因分子生物学水平上的热带果树研究与热带农业科学研究奠定基础。

　　关键词：热带果树；基因；分离；克隆；

　　作者简介：安娜，女，硕士研究生，研究方向：热带果树与农业生物技术；E-mail:960089206@qq.com;陈萍，女，博士，副教授，研究方向：热带果树与农业生物技术；E-mail:chenping199607@163.com;

　　基金：国家自然科学基金项目（31560544）；海南省自然科学基金项目（20153061）；海南省高等学校科学研究项目（HNJG2014-05）；

　　Abstract:Firstly, we summarized the isolations of the genes from several common tropical fruits' genes（banana, papaya, mango,pineapple, litchi, etc.）by frequently used technologies of rapid-amplification of c DNA ends（RACE）and reverse transcription-polymerasechain reaction（RT-PCR）， also the analyses and expressions of cloned target genes and fragments. Finally, we discussed the advantages anddisadvantages of gene isolating and cloning technologies, and prospected the new gene isolating and cloning technologies, aiming at laying thefoundation for studying tropical fruit tree and agriculture at biological level of genetic molecule.

　　Keyword:tropical fruit tree; gene; isolation; clone;

　　南回归线与北回归线之间的地区为热带地区，适应这种热带地区气候并能够在该地区生长的果树通常被人们称之为热带果树，海南及云南南部热带、亚热带水果种类非常丰富，有些为海南所特有的热带水果品种。近年来，基因分离技术已经广泛的应用于现代农业研究领域，也逐渐被更多地应用到热带果树的研究上，基因克隆技术成熟大约是在20世纪70年代初期，通常基因克隆技术是将来自不同生物的基因与能够进行自我复制的载体DNA在体外进行人工拼接，构建成新的c DNA文库，常见的基因分离方法有基因文库、基因芯片、功能蛋白组分离目的基因、聚合酶链式反应（PCR）、m RNA差别显示、插入突变分离克隆目的基因、图位克隆目的基因、酵母双杂交系统分离克隆基因、生物信息学技术以及诸如基因表达系列分析（SAGE）、抑制性差减杂交（SSH）等的克隆基因新技术[1] .如今科研人员最常用的几种主要方法为功能克隆法、转座子标签法、序列克隆法、图位克隆法、m RNA差别显示PCR法、差别筛选法和差减杂交等。这些分子生物学方法，并不是只能单独使用，也能够将两种或多种方法结合使用以提高目的基因分离的精度与纯度。下面根据主要的热带果树品种来阐述近年来基因分离与克隆技术成功应用的实例与总结。

　　1 热带果树基因分离技术应用与总结

　　1.1 香蕉基因分离的研究

　　香蕉（Musa nana Lour.）是一种大众普遍喜爱的热带水果，近年来，基因分离技术在香蕉选种育种中发挥了重要的作用，目前香蕉的基因组测序已经完成，2012年，由法国研究人员领导的国际小组采用Roche454、Sanger和Illumina的测序方法成功绘制出了523 Mb的香蕉双单倍体小果野蕉的基因组图谱。张俊芳[2] 在2013年通过SSH技术克隆出了香蕉乙烯应答因子结合蛋白（ethylene responsive factor binding protein,ERF）基因并命名为Ma ERF和决定表皮毛发育的关键转录因子MYB基因并命名为Ma MYB基因，这些基因都与香蕉的果皮带毛基因有关；赵巧阳[3] 在其实验中克隆了1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）基因，ACS是乙烯合成中的限速酶，对今后香蕉品种的改良研究具有十分重要的价值。但是香蕉枯萎病让大量的香蕉绝产，基因分离技术在香蕉病害的研究也日渐成熟，陈雅平等[4] 通过运用抗病基因同源克隆技术（RGAs）发现，WNB1和WST1的表达量增加，表明这两个同源抗病基因可能和香蕉枯萎病的抗性有一定关系；孙嘉曼[5] 在其文章中提到运用高通量测序技术对香蕉枯萎病进行更加深入的研究。还有一些研究着重于香蕉自然抗性上，刘德兵[6] 在实验中用ADGE法分离了与冷诱导相关的基因；匡云波[7] 在其实验中克隆了大量的与香蕉叶片糖代谢有关的几个关键酶基因（AMY、BMY、SPS、SSIII、Su Sy、Inv和GBSSI），并研究了其在低温胁迫下的表达；Wang等[8] 克隆了8个钙依赖性蛋白激酶（CDPK）基因，该基因在香蕉苗的生长与胁迫应答中扮演重要角色，Wang等[9] 从香蕉中克隆了Ma ARF基因，并分析了其在香蕉成熟过程中的表达变化，实验证明该基因在香蕉采后成熟过程中有诱导乙烯的合成的作用。

　　1.2 番木瓜基因分离的研究

　　番木瓜（Carica papaya L.）是一种常见的并且含有丰富营养成分的大众非常喜爱的热带水果。2008年，首个番木瓜基因草图被成功绘制出来，这张草图是由南开大学和美国的研究机构一起进行的联合研究。该草图成功绘制出了90%的番木瓜基因编码序列，番木瓜是到目前为止有详细基因组信息的第5个被子植物。其它的几种植物分别为拟南芥、水稻、白杨和葡萄。番木瓜属于呼吸跃变型水果，Mason等[10] 从番木瓜中分离了两个ACC合成酶基因的c DNA全长，Lin等[11] 、Hidalgo等[12] 也都克隆了ACS基因，申艳红[13] 克隆了内参基因Cp Actin全长c DNA序列，番木瓜果实半定量RT-PCR分析技术体系也成功建立了；李泽友[14] 克隆了与番木瓜苄基硫苷类物质（benzyl glucosinolate,BG）生物合成相关的基因它们分别是（CP-CYP79A2.1、CP-CYP79A2.2、CP-CYP83B、CP-C-S、CP-UDP-T及CP-ST5a），这些相关基因可编码产生有防癌抗癌功能的异硫氰酸酯类物质；言普等[15] 克隆了番木瓜的IF（iso）4E基因；林莹[16] 在实验中克隆出了具有抗软化功能的果胶裂解酶基因（pectinlyase,PL），为耐贮藏番木瓜的育种工作打下了基础；申艳红利用c DNA-AFLP技术克隆出了番木瓜半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease,CP）的Cp CP基因，该基因属于C1肽酶家族中的C1A亚家族，与番木瓜果实成熟衰老进程有关[17] ;赵新伟[18] 利用RACE和RT-PCR技术克隆了类胡萝卜素生物合成途径相关的PDS、ZDS和LCY-B的c DNA序列，为番木瓜果肉颜色形成机理研究奠定了分子基础；Vallejo-Reyna等[19] 克隆了乙烯影响因子ERF转录因子基因，并分析了其在不同组织中的表达差异；番木瓜环斑花叶病是一种流传于番木瓜间的病毒性病害，杜中军等[20] 根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类（serine/threonine protein kinase,STK）抗病基因产物催化结构域I和IX的氨基酸保守序列设计简并引物，克隆了g PK1-g PK5和c PK1-c PK4基因；与抗病有关的同源基因（Resistance Gene,R）也从番木瓜中被成功克隆；徐兵强[21] 运用了根据保守序列设计简并引物寻找R基因同源序列（resistance gene analogs,RGA）的方法从番木瓜中成功克隆出了2条NBS-LRR类（Nucleotide bindingsite-leucine-rich repeats）RGAs序列和5条STK类RGAs序列。

　　1.3 芒果基因分离的研究

　　芒果（Mangifera indica L.）是一种热带漆树科常绿大乔木果树，在中国的南方的边疆六省（海南、广东、广西、云南、福建和台湾）都有种植，原产自印度，孟加拉、中南半岛和马来西亚也有种植，世界各地广为流传，中国栽培已达40余个品种，对于芒果的研究一般集中在芒果成熟及其抗性相关基因上。李运合等[22] 采用RT-PCR结合RACE方法从芒果品种紫花芒中分离了乙烯受体基因Mi ETR1b,并对此基因进行分析，得出Mi ETR1b为ETR1家族同源基因，参与调控不定根的形成；肖洁凝等[23] 采用SSH方法分离了芒果中与子叶切段不定根形成相关的基因，这些基因与转运蛋白、转录调控因子及酶基因的DNA序列同源；赵常志[24] 采用RT-PCR和RACE方法从芒果果实中克隆得到了查尔酮异构酶基因（CHI）的全长c DNA序列，该酶是类黄酮化合物合成途径中的关键酶；赵常志用3'RACE和5'RACE法分离得到了芒果果实PAL的基因序列，PAL是酚类物质合成的第一个酶，对不同芒果品种的PAL基因的表达分析发现，红色贵妃品种该基因的表达量高，而绿色桂七品种中该基因的表达量低[25] ;魏军亚[26] 利用RT-PCR和RACE技术克隆得到（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1,SOC1）基因，该基因有调控植物开花的作用，命名为MSOC1;刘洋等[27] 从金煌芒基因组DNA中分离得到了10条具有潜在功能的抗病基因片段；张波等[28] 运用同源克隆的方法克隆了与调控花色苷合成有关的DRF基因，并分析了不同芒果品种中该基因的表达差异；董龙等[29] 对四季芒不同逆境胁迫处理样品做基因差异显示研究，设计引物，从中克隆了类黄酮磺基转移酶（flavonoid sulfotransferase）基因（Mi ST），类黄酮磺基转移酶这一基因可能与芒果中的黄酮生物合成有关。余海霞等[30] 根据芒果c DNA-SCo T差异显示中发现的c DNA片段设计特异引物，通过运用RACE技术获得了芒果Mi NAC基因的全长c DNA序列，该基因参与芒果逆境胁迫的分子调控；张宇等[31] 采用RT-PCR和RACE技术顺利从芒果的枝梢中分离出了芒果的肉桂酰辅酶-A还原酶基因（CCR），该基因参与木质素生物合成，后又对此基因进行了生物信息学分析；Nakagawa等[32] 从芒果中分离了与成花有关的基因FT-like和GA代谢相关的基因GA3-ox,Mi FT被认为是芒果开花的关键基因，该基因的表达调控经由GA代谢来实现；Ish-Shalom等[33] 分离了乙烯受体基因ERS1,并命名为Mi ERS1,并指出Mi ERS1具有的特殊功能，调控小果的脱落。

　　1.4 菠萝基因分离的研究

　　菠萝（Ananas comosus Linn.Merr.）是凤梨属凤梨科植物，多年生常绿草本，适应热带和亚热带气候，明末清初传入中国南方等地[34] .DNA克隆技术在菠萝中的应用很广泛，如菠萝花发育相关基因的克隆、菠萝果实发育相关基因的克隆、菠萝抗逆相关基因的克隆等。马均等[35,36] 克隆并分析了菠萝的体细胞胚发生类受体蛋白激酶（SERK）基因，该基因与早期的体胚诱导与形成有关，并将Ac SERK2与Ac SERK1进行了比较；王尉等[37] 利用生物信息学分析已构建的菠萝果实不同发育时期的c DNA文库，对未知基因序列重复同源性检索、拼装，用RT-PCR验证目的基因的正确性，克隆了与菠萝果实发育相关的RFD1基因；蔡元保等[38] 利用同源克隆结合RACE技术，从菠萝花中分离出了一个新的与菠萝花器官发育和开花诱导过程中起重要作用的MADS-box基因，并分析了此基因在菠萝果肉以及花器官的雌蕊、花瓣和萼片中的表达量；杨祥燕等[39] 通过RT-PCR结合RACE方法从菠萝幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因的c DNA全长，并命名为Ac RCHY1;Lv等[40] 分离了FT基因的全长，命名为Ac FT基因，并分析了其表达差异；Raimbault等[41] 从菠萝的果肉中分离了天冬氨酸蛋白酶基因Ac AP1,该基因与菠萝的低温胁迫有关。

　　1.5 荔枝基因分离的研究

　　荔枝（Litchi chinensis Sonn.）原产于中国南部，是亚热带果树，不耐储藏，坐果期易落果，与香蕉、菠萝、龙眼并称"南国四大果品".吴建阳等[42] 用RT-PCR和RACE扩增技术相结合的方法克隆了ACO基因，首次从荔枝中分离得到的ACO基因命名为Lc-ACO1,该基因可能与荔枝幼果的脱落密切相关；丁峰等[43,44] 用RT-PCR方法首次克隆得到荔枝AP1同源基因c DNA全长，第二次得到两个荔枝FT同源基因c DNA全长，分别命名为Lc FT1和Lc FT2,Lc AP1基因可能参与荔枝营养生长向生殖生长的转变，花发育过程及营养生长调控过程，FT基因是长日照途径中决定植物开花时间的关键基因，是一个重要的光周期途径和春花途径的整合因子；张静等[45] 从荔枝中分离出了一个与成熟衰老有关的诱导基因，命名为Lc Asr,该基因作为缺水的保护性分子发挥着重要作用，有利于今后辅助研究采后荔枝果实失水的分子机理；王凌云等[46] 利用RT-PCR从荔枝组织中克隆了9个质膜水孔蛋白基因（Lc PIP）的c DNA全长序列，并研究了其组织特异性表达。

　　1.6 龙眼基因分离的研究

　　龙眼（Dimocarpus longan L.）属于无患子科龙眼属多年生木本植物，果实肉质柔滑，沁口味甜，是我国具有重要经济价值与药用价值的名特优果树。龙眼果实集中在八月到九月期间上市，由于其上市时间的过于集中，因此龙眼的生长调控相关基因的研究也便具有了重要意义。李慧华等[47,48] 克隆了胚性愈伤组织ACO氧化酶基因，还克隆了龙眼的胚性愈伤组织生长素受体基因TIR1和生长素结合蛋白基因ABP1;孟珊等[49] 从四季蜜龙眼中分离了LFY基因的启动子，LFY基因与四季蜜的成花特性有关；陈虎等[50] 克隆了龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶DLCCo AOMT基因，该基因可能参与低温胁迫后植物的生理变化调控；Winterhagen等[51] 从龙眼中分离了两个和成花有关的Dl FT1和Dl FT2基因，并且还分离了Dl AP1-1和Dl AP1-2基因，并做了进一步的分析。

　　1.7 椰子基因分离的研究

　　椰子（Cocos nucifera L.）棕榈科椰子属植物，原产于亚洲东南部、印度尼西亚至太平洋群岛，是热带木本油料作物之一。具有极高的经济价值，全株各个部分都有重要用途。韩闯等[52] 根据SOD基因保守序列进行PCR扩增，分离出了Cu·Zn-SOD基因片段，超氧化物歧化酶（SOD）催化超氧阴离子（O2-）发生歧化反应，该过程能够专一清除生物体内的超氧阴离子；肖勇等[53] 克隆了椰子的硫脂酶相关基因（Acyl-ACP）；张琳[54] 克隆了椰子胚乳中WRI1-like类转录因子Co WRI1基因；Gao等[55] 从椰子胚乳中分离出了Coco FAD基因，该基因与十六碳烯酸和十八碳烯酸的生物合成有关；Yuan等[56] 从椰子的胚乳中分离出来了植物溶血磷脂酸酰基转移酶LPAAT基因，并命名为Cn LPAAT,Cn LPAAT基因在Kennedy途径中的第二步有着重要的催化作用，使酰基链从酯酰-Co A转移到溶血磷脂酸（LPA）的sn-2位，后产生的磷脂酸可以进行脱磷反应合成三酰甘油（TAG）和进入磷脂合成途径参与形成生物膜结构[57] .

　　1.8 优稀果树基因分离的研究

　　优稀果树的栽培面积小，对优稀果树在基因分离方面的相关研究少，因此下面只做部分介绍。

　　菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），桑科、菠萝蜜属常绿乔木，是热带果树，也是世界上单果重量最重的水果。汪永保等[58] 利用RACE技术从菠萝蜜中分离出了β-半乳糖苷酶基因（β-GAL），并对其进行了生物信息学分析。近些年发现，该基因是与果实成熟与软化有密切关系的糖苷酶类物质。

　　番荔枝（Annona squamosa L.），是热带、亚热带水果，可鲜食，其根部可药用，治疗赤痢等病，营养价值颇高。番荔枝的花器官发育过程中牵涉到大量基因的表达和调控，其中AGAMOUS（AG）是C类MADS-box家族的转录因子，具有调控雌蕊与雄蕊发育的功能，是控制花器官形成的一个重要的基因，刘锴东等[59,60] 通过试剂盒提取RNA运用RACE方法从番荔枝花器官中克隆出了AGAMOUS基因的全长序列，克隆了与花器官发育初期发挥重要作用的LEAFY基因。

　　莲雾（Syzygium samarangense）是热带常绿果树，果实成熟期从11月到翌年4月，是一种优质特色水果，营养价值非常高。韩继成等[61] 从莲雾的基因组DNA中分离出了乙烯受体基因（osers）的保守片段，对莲雾的保鲜贮藏有重要作用，可以用于今后进行莲雾果实发育及采后保鲜储藏等方面的研究。

　　枇杷（Eriobotrya japonica Thunb.Lindl）原产中国东南部，果肉香甜，且具有药用价值。杨岑等[62] 从枇杷中克隆和鉴定了8个新S-RNase基因，并根据分离的这8个基因进行了同源性的推导。

　　2 展望

　　随着分子生物技术的不断进步，人们对基因的认识越来越深刻，高通量测序技术的不断改进与完善，扩大了热带果树目的基因分离的研究范围。目的基因的分离，有利于直接对其进行结构、功能及调控等一系列问题的进一步研究。现今，基因测序技术诸如RNA-seq等已经广泛地应用到了热带果树植物（包括一些木本和草本果树植物）特别是非模式生物中，使热带果树的目的基因分离技术研究进入到了一个迅速发展的时期。高通量生物技术的快速发展及与多学科的融合，已经可以运用系统生物学来揭示和阐明植物部分生理生化反应或代谢机制。转录组学、蛋白质组学及代谢组学等方面研究，有望能够更全面系统地揭示植物的各项生命活动分子机理，但这些系统研究还需进一步深化。技术的不断普及与推广，使分离完整目的基因序列的精度不断提高，但仍存在着3个重要的问题：一是热带果树目的基因的分离与克隆只能借鉴模式植物和大田作物，目前已经成功克隆和分离的目的基因或片段绝大多数与果实的发育、成熟衰老过程有关；二是热带果树目的基因的分离与克隆方法，与大田作物和模式植物对比分析不难看出，两者存在着很大的差异性，因此会产生一些特殊情况，除少数草本水果外，大多数热带果树为木本植物，受遗传转化技术和组织培养技术的限制，使其在转基因方面的研究相当困难，因此，应积极寻找适合热带木本果树遗传转化和组织培养的方法，使其逐渐形成一条有计划的科学的系统研究体系；三是基因分离技术及方法各自有其优点，但也存在着不可避免的缺陷，农业科研人员应该根据自身的需要进行选择，还可根据实际要求将多种技术进行有机的结合，如将SSH与c DNA芯片联合使用等，是今后基因分离与克隆技术研究发展的方向所在。

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