启动子克隆技术和调控功能在牛领域中的应用

克隆技术论文第五篇：启动子克隆技术和调控功能在牛领域中的应用

　　摘要：基因启动子 （promoter） 是DNA上决定RNA聚合酶转录起始位点的序列， 是基因的一个重要组成部分， 控制基因表达的起始和表达的程度， 而基因表达的最终产物是RNA和蛋白质， 这两大类物质对维持生命活动不可缺少。因此， 对基因的启动子进行克隆并研究其功能对研究基因表达调控机制具有重要意义。本文主要就两种常用的启动子克隆技术和启动子调控功能的研究进展做了简要综述， 并对启动子的研究前景做了展望。

　　关键词：启动子克隆，牛；功能基因，调控功能，

　　作者简介：卢明雪 （1996-） , 女， 河南新乡人， 本科， 主要从事生物科学研究。；马云 （1974-） , 男， 宁夏平罗人， 博士， 教授， 主要从事生物技术与动物遗传育种研究。；

　　基金：国家自然科学基金 （No.31172193）；河南省优势特色学科一期建设工程项目 （大别山农业生物资源保护与利用特色学科群）；河南省高校科技创新团队项目 （No.14IRTSTHN012）；信阳师范学院青年科学基金 （2015037） 资助；

　　Abstract:Gene promoter is an important part of the gene, which is a DNA sequence determining RNA polymerase transcription start site.It can controls the start of gene expression and expression level.The gene expression products are mRNA and protein, which are necessary for maintaining the life activities.Thus, it is vital important to study on the promoter function of a gene and it's regulation mechanism.In this paper, two common cloning technology and the regulation function of the promoter and prospected the in cattle were summarized.

　　Keyword:promoter cloning; cattle; functional gene; regulatory function;

　　引言

　　基因的表达主要包括DNA的转录和RNA的翻译两部分， 其中， DNA转录部分主要由该基因起始转录位点上游的启动子序列所决定。启动子元件包括核心启动子元件和上游启动子元件。核心启动子元件决定了转录起始位点并起始转录， 上游启动子元件通过TFII-D复合物调节转录起始的频率， 提高转录效率。因此， 启动子控制基因表达的起始时间和表达的程度， 是基因表达调控的重要顺式作用元件， 同时也是基因工程表达载体的一个重要元件， 在整个基因研究领域发挥着重大的作用。因此， 对启动子的研究已成为近年来基因工程研究的热点。在牛上， 功能基因占很大比例， 每个功能基因均存在启动子， 启动子完整与否关系到该基因的表达与否及表达量的高低， 进而影响对应的生理过程的发挥和相关表现型。因此， 在对牛重要经济性状的研究中， 对基因启动子功能的研究是研究该基因对特定性状的影响作用不可忽略的一部分。本文主要对两种常用的启动子克隆技术、功能基因启动子调控功能研究进展方面做了简要综述， 为功能基因启动子的研究提供参考。

　　1 启动子克隆技术的研究进展

　　1.1 利用启动子探针载体筛选启动子

　　利用启动子探针载体筛选启动子， 是指通过将内切酶切割得到的不同拟启动子片段连接到含有报告基因的载体上， 检测下游标志基因的表达活性以判断拟启动子片段的转录活性的一种方法。该方法选用适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA, 然后将切割产生的DNA限制片段群体与启动子缺失质粒载体重组， 并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞， 构建质粒载体基因文库， 并检测报告基因的表达活性， 若检测报告基因具有活性， 则该插入重组DNA片段具有启动子活性[1].构建含报告基因的启动子缺失质粒载体筛选启动子是一种高效、快速分离启动子的方法。

　　该方法的最早是由Rachael等在大肠杆菌中以四环素抗性基因作为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B, 并克隆得到一些原核和真核启动子片段。随后， Fodor等[2]以大肠杆菌LacZ为报告基因构建了酵母启动子探针质粒载体并克隆得到一些启动子片段。同样， Donna等[3]以氯霉素抗性基因作为报告基因， 构建酵母启动子探针质粒并克隆得到一些启动子片段。张勇为等[4]以大肠杆菌质粒载体pBlue或pUC18为骨架， 用大肠杆菌转座子Tn903的卡那霉素抗性 （Kan'） 基因为遗传标记， 构建了启动子探针型系列载体pSUPV.魏云林等[5]以pBR322质粒为基础， 用来源于质粒pJRD215的卡那霉素抗性基因片段作为遗传标记， 并在pBR322中插入Acinetobacter菌属特异性ori的DNA片段， 构建了能在Acinetobacter sp.DWC6和E.coli中正常复制的启动子探针质粒pBAP1, 从而筛选强启动子片段。张维等[6]以β-葡糖醛酸酶基因gusA作为报告基因， 在乳酸菌表达载体pMG36e基础上， 构建了乳酸菌启动子探针载体pMGPP, pMGPP的构建不仅为筛选乳酸菌启动子提供了有效的工具， 同时为高效乳酸菌表达载体的构建奠定基础。杜宝华等[7]以半乳糖苷酶基因作为报告基因， 构建启动子活性探针载体pMPlacZ, 并且其构建的启动子活性检测载体可以有效、灵敏地用于甲基营养菌MP688强启动子的筛选和启动子活性检测。尽管该方法能够用于随即筛选启动子， 获得大量未知序列启动子片段， 但不能特异分离某一特定基因的启动子片段而使其应用受到局限。

　　1.2 利用PCR技术克隆启动子

　　该方法主要对于已知的基因序列， 即根据已经发表的基因序列设计引物， 通过PCR技术克隆得到基因的启动子， 并构建含有报告基因的载体， 转染细胞后检测报告基因的表达以判断目的序列的转录活性。由于该方法比较简便、快捷， 近年来研究者们较多采用此方法克隆基因启动子。

　　2012年， 王秋华等[8]根据已公布的牛MyoG （Myogenin, 肌肉生长相关因子） 基因的启动子序列， 扩增启动子缺失序列， 利用双荧光素酶报告基因检测系统分别检测启动子序列野生型和突变型的转录活性， 结果表明， 日本和牛MyoG基因 （ID:281343） 的166~2125bp区域内不同长度片段均存在不同转录活性， 该结果为进一步研究MyoG基因的表达调控奠定了基础。2013年， 刘敏等[9]采用PCR技术扩增牛MSTN基因启动子， 亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中， 构建重组报告载体pGL3-BasicMSTN-promoter, 将重组报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter与内参质粒pRL-TK用脂质体法瞬时共转染小鼠成肌细胞系C2C12和小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1, 通过双荧光素酶活性检测其启动子活性， 结果成功构建了牛MSTN基因真核报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter, 并且该载体在C2C12细胞和3T3-L1细胞中的启动子活性比pGL3-Basic空载的活性高， 这为进一步研究MSTN基因的表达调控机制奠定了基础。为检测牛在C2C12细胞系中的表达活性， 2015年， 段美艳等[10]通过PCR技术从牛基因组DNA中克隆获得目ATP5B基因拟启动区不同截短片段， 成功构建7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒， 且证实-763~230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。利用相同的方法， 王明明等[11]研究发现牛MYOZ2基因启动子核心区位于-84/+125bp, 而且MEF2, SRF, MyoD, YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控；陆杏蓉等[12]克隆获得的水牛NOBOX启动子能够启动EGFP在HEK-293T细胞上表达， 也能够启动EG-FP在CHO细胞上表达， 且与CMV启动EGFP在CHO细胞中的表达强度相似， 表明获得的水牛NOBOX是个强启动子。2016年， Xu等[13]通过克隆小鼠IRF-3 （The interferon regulatory factor 3, 干扰素调节因子3） （mIRF-3） 基因5'侧翼区的核苷酸序列， 并根据其在NIH3T3细胞中调控mIRF-3基因的转录活性的分子机制的特点， 分析一系列5'缺失序列， 结果显示mIRF-3基因中的一段长301bp的片段 （-255/+46） 对于启动子的活性是必不可少的， 这个区域包含IK1, Egr2, Cmyb, E2F1and YY1这5个假定的转录因子结合位点， 之后通过siRNA策略敲除Egr2或YY1以及染色质免疫共沉淀试验， 最终结果表明NIH3T3细胞中的转录因子Egr2和YY1能够调控mIRF-3的基础启动子活性。

　　启动子克隆技术的方法有很多， 除利用启动子探针载体筛选启动子以及PCR技术克隆启动子两种技术外， 还有利用环状PCR （包括Inverse-PCR和Panhandle-PCR） 、载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子、YADE法、TAIL-PCR等其他技术。这些已经被人们广泛使用， 每种方法都有各自的利弊， 但因PCR技术更为方便、快捷， 因此是目前人们使用最多的方法。

　　2 牛功能基因启动子调控功能的研究进展

　　2.1 肉用性能相关功能基因启动子调控功能的研究进展

　　1997年， Hinshelwood等[14]根据牛CYP19基因在子房 （OV） 和胎盘 （PL） 的特点， P450芳香酶 （CYP19基因的产物） 在牛和人的子房颗粒细胞中均能表达， 然而在排卵之后只在人类黄体化的颗粒细胞能够持续表达， 之后在牛和人的CYP19基因的启动子和5'侧翼区亚克隆一个LUC （luciferase, 荧光素酶） 载体， 转染细胞检测活性， 结果表明在防止牛CYP19基因在黄体化的颗粒细胞中充分表达方面， CLS （cAMP-responsive element-like sequence, 类似cAMP应答元件的序列） 发挥了重要的作用。2011年， 王洪梅等[15]将牛Nramp1 （Natural resistance-associater macrophage protein, 天然抗性相关巨噬蛋白） 基因起始转录位点上游不同长度片段连接到pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒中， 将获得的重组质粒转染293T和RAW264.7细胞， 并进行脂多糖诱导， 对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定， 最终确定该基因启动子核心区域和主要的调控区域。2013年， Wang等[16]将CMV增强子的一个片段与MyoG基因启动子上游连接到一起， 构建双荧光素酶表达载体和4个真核基因表达载体， 然后将这4个载体和内控的海肾荧光素酶报告基因载体phRL-TK转染到牛的骨骼肌卫星细胞中和牛犊成纤维细胞中， 检测双荧光素酶报告体系中的启动子活性， 结果表明CMV增强子能够显著地提高MyoG基因启动子在肌肉卫星细胞中的转录活性， 并且具有特异性， 本研究在提高外源基因在牛肌肉细胞中的高效表达方面提供了试验材料， 并为获得牛肌肉中启动子的高特异性和转基因肉牛提供了理论基础。同年， 李飞等[17]根据GenBank中牛的MyoDⅠ基因序列， 用PCR技术扩增牛MyoDⅠ基因的拟启动子区域， 构建载体并转染293T细胞， 分析发现扩增的关岭牛MyoDⅠ基因拟启动子区域具有转录活性。2014年， 杜巍等[18]扩增牛结蛋白不同长度的启动子截短片段， 构建载体并转染不同细胞， 发现克隆的不同启动子截短片段均存在不同程度的转录活性， 这为转基因肉牛的生产奠定了基础。2015年， 孙晓丽等[19]为获得带有高效特异性启动子的IGF2 （Insulinlike Growth Factor 2, 胰岛素生长因子） 表达载体， 研究其对牛骨骼卫星细胞增殖的影响， 成功构建了3种含有IGF2肌肉特异性启动子desminpro、CMV-MyoGpro和MyoGprodouble的真核表达载体转染牛骨骼肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞， RT-PCR检测IGF2的相对表达量， 从而筛选高效特异性的载体。结果表明， pGL3-desminpro-IGF2是较高效的并具有特异性的载体， 载体转染体外培养细胞提高了增殖速度， 并上调了细胞周期相关基因CDK6和IGF2的表达， 为转基因肉牛的生产奠定了重要基础。2016年， 张雯等[20]通过设计特异性引物克隆关岭牛MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子片段P1和P2, 同时利用双酶切的方法分别将CDS区和克隆的启动子序列连入pcDNA3.1 （+） 和p GL3-Basic基本骨架， 构建真核表达载体pcDNA3.1 （+） -Myf5、pcD-NA3.1 （+） -Myf6、pcDNA3.1 （+） -MyoD、pcD-NA3.1 （+） -Myo G和含萤火虫荧光素酶报告基因的报告载体， 经酶切和测序鉴定后， 将真核表达载体和报告载体转染小鼠C2C12细胞， 结果表明关岭牛MyoD、Myf5和Myf6转录因子与关岭牛MyoD1启动子的作用位点不在其核心启动子区P2上。

　　2.2 奶牛功能基因启动子调控功能的研究进展

　　2013年， 郑宜文等[21]采用亚硫酸氢盐测序 （BSP） 技术检测了不同发育时期奶牛乳腺组织及不同乳品质泌乳期奶牛乳腺组织RPS6KB1启动子的甲基化特征， 实时荧光定量PCR检测RPS6KB1基因mRNA差异表达， 实验结果显示， 在RPS6KB1基因启动子内存在CpG及非CpG的甲基化模式， 妊娠期奶牛甲基化程度高于泌乳期奶牛， 荧光定量结果显示不同发育时期RPS6KB1基因mRNA水平表达差异显著 （P<0.05） , 说明RPS6KB1的表达受到其启动子甲基化的调控， 非CpG甲基化模式可能具有与CpG甲基化模式相似的生物学功能， 参与RPS6KB1的表达调控。同年， 韩立强等[22]从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段 （分别为212、380、416和760bp） , 采用生物信息学方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点， 将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行双酶切， 连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3、pGL3-SCD4, 将载体纯化后， 瞬时转染到HepG2细胞， 之后检测启动子荧光素酶相对活性， 结果表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段 （-398~-742） 可能对于SCD基因的表达调控具有重要的作用。2016年， Hou等[23]已知SYK （Spleen tyrosine kinase, 脾酪氨酸激酶） 在干乳期的乳腺组织中的表达量比在泌乳期中的高， 奶牛的乳腺上皮细胞以及与细胞增殖有关的信号分子能够影响SYK的表达水平， 使用双荧光素酶报告基因进行分析， 表明SYK能够增加AKT1基因启动子的转录活性， 这些结果表明， SYK激活AKT1在奶牛乳腺的转录水平影响乳腺上皮细胞的增殖， 这在不产乳的奶牛的乳腺重塑过程中以及提高泌乳奶牛的泌乳持久力方面发挥重要的作用。

　　3 小结与展望

　　启动子是基因的一个组成部分， 控制基因表达的起始时间和表达的程度， 启动子就像"开关", 决定基因的活动。对启动子进行研究不仅为研究物种进化规律以及生物的生长发育提供依据， 也为研究疾病的治疗提供理论依据。启动子作为后基因组时代的研究重点， 其调控表达中序列和功能的关系、拷贝数和功能的关系、在基因中的位置和功能的关系、不同启动子之间复杂对应网络和功能的准确对应关系等方面有广阔的研究空间和发展前景， 启动子领域的研究进步是后基因组时代发展的重要体现， 在牛领域中关于启动子的研究更是取得了很大的进步， 相信通过研究人员的不懈努力， 能够为启动子的研究提供更多的理论依据和实验依据。

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