基因检测中病理标本DNA提取经验总结

　　随着分子生物技术在临床中开展， 其所覆盖的检测疾病的范围越来越广， 不仅在常规医学检验中，近年来随着临床靶向治疗的普及，病理肿瘤标本的相关基因检测也得到发展。 然而，什么样的病理标本适合做基因检测？ 怎么才能够得到更多更好的 DNA 呢？ 是目前我们病理科开展此项目所面对的问题。 经过我们不断实践，现将几点体会介绍如下。

　　1 标本及时合适的固定是石蜡标本基因检测的关键步骤
　　
　　活组织或脱落细胞应得到及时且合适固定液固定， 一般活组织离体 30 min 内冻存或 10%中性缓冲福尔马林固定，脱落细胞应及时离心，-80℃保存或用棉絮纸包裹，按组织常规处理。 合适固定液及时固定可以大大降低 DNA 的降解，减少基因的片段化，同时避免使用含重金属固定液，如 Bouin液等。 若标本固定不佳，在后期的标本制备过程则无法加于纠正。 临床送检组织标本时间与固定后标本取材时间之差最好统一， 一般为 6~48 h 为好[1,2]. 活检小标本一般为 6~12h, 组织大标本为 6~48h 且按要求剖开固定，保证标本充分固定，有效保护细胞中 DNA 质量，提高 DNA 提取效率，保证检测结果的可靠性。

　　2 足够的肿瘤细胞是石蜡标本基因检测的必备要求
　　
　　足够的肿瘤细胞是基因检测 DNA 提取的基本条件，也是必备要求。 在挑取肿瘤组织蜡块时，应充分地考虑肿瘤细胞数量、 组织类型及避开坏死组织等。 在提取标本 DNA 时一般应首先进行病理评估，了解肿瘤细胞的数量、肿瘤细胞百分比及组织类型， 如达不到病理评估的要求则应终止下游基因检测，符合要求进行下游检测。 实际过程中我们可在切取病理石蜡标本做 DNA 提取时切一张白片用于 HE 染色于判断肿瘤百分比及肿瘤细胞数。 如该标本已行免疫组化检测时不能将用于常规病理诊断的 HE 染色制片中肿瘤细胞分布情况用于病理评估，在切取标本提取 DNA 时再切一张白片用于染色， 以免免疫组化检测后肿瘤细胞数量不足，特别是活检小标本。 肿瘤细胞含量的最小比例应由不同检测方法的敏感度决定， 专家共识认为要求肿瘤细胞数一般要求大于 200 个，且肿瘤细胞应占整张切片所有细胞 10%以上[2]. 实际操作中应尽量刮取肿瘤细胞丰富的区域且避开坏死或红细胞较多的区域用于 DNA 的提取， 可以提取到高质量相关 DNA,特别是测序技术，同时可降低PCR 扩增抑制物的存在。 手术根治标本是我们病理基因检测的最好标本，肿瘤细胞较多、含量比例高。

　　相反，活检小标本一般肿瘤细胞数偏少。 如肿瘤细胞数量不够， 可多切组织切片弥补肿瘤细胞不足，但应保证肿瘤细胞占整张切片所有细胞 10%以上，如肿瘤细胞所占比例小于 10%,组织标本应脱蜡后切除无关细胞已达到要求，这样肿瘤细胞提取相关DNA 质量仍好。 同时应对病理评估结果做好记录，方便与 DNA 提取结果进行比较，累积经验。

　　3 DNA 提取是石蜡标本基因检测的前提条件
　　
　　3.1 标本的选择 一般选择病理组织蜡块保存时间越短越好。 组织标本经过福尔马林固定，可引起组织蛋白与核酸交联反应。 石蜡组织标本保存时间越长，核酸片段化越严重，加剧核酸甲基化修饰，核酸提取质量越差，浓度偏低[3]. 保存时间长的标本切片时应尽量切掉与空气接触的外层组织再切取组织进行 DNA 提取，特别是未行封蜡的组织蜡块。

　　3.2 标本的处理 石蜡标本在进行切片前，应将切片机清洁干净，可用 75%乙醇消毒台面及镊子等。

　　每个标本应选择一个刀口， 严格控制标本间交叉污染。 手术根治标本最好选择 5μm~10μm 切片黏附载玻片上，脱蜡完后用手术刀转移组织，简便、省时； 而活检小标本可以选择 EP 管收集连续切片，管内脱蜡，达到尽可能收集肿瘤细胞。 在进行组织切片时不建议厚度超过 10μm 或低于 5μm,过厚组织切片会增加脱蜡的困难， 也增加细胞酶消化和裂解的难度； 过薄则容易产生 DNA 断裂。

　　如选择 EP 管二甲苯脱蜡时乙醇去除二甲苯后，应晾干方可进入下一步骤， 残存有机溶剂会降低提取率及后续扩增效率。 对于 EP 管脱蜡，应关注 EP管底至少有肉眼可见的样本存在， 以保证足够DNA 用于下游检测。

　　3.3 DNA 的提取 DNA 提取一般情况下应严格按照本实验室的 SOP 文件执行， 然而在实际操作过程中往往要对不同情况进行针对性处理， 才能获得比较满意的结果，笔者归纳如下。

　　3.3.1 酶及裂解 实验中标本消化一般用蛋白酶 K,其浓缩粉末可室温 15~30℃保存， 分装完应放入-20℃保存。 DNA 提取操作中首先温度设定为 56℃蛋白酶 K 的消化及裂解过程， 最佳工作消化时间视标本而定，不同的标本一般不一样[4]. 过量的标本含量将影响酶的消化及裂解效果， 标本含量越多消化及裂解时间应越长， 酶消化完成后应检查酶消化效果， 如还有很明显的组织漂浮物应说明样本加入量偏大应适度延长酶消化时间。 适量加大酶量或延长消化时间有助于加强消化裂解作用[5,6]. 蛋白酶 K 消化一定要满足 DNA 释放完全有效，保证以满足后续实验需要 DNA 的量[7]. 蛋白酶K 消化裂解后进入 90℃灭活， 此阶段裂解液对修饰 DNA 及释放 DNA 进一步发挥作用。

　　3.3.2 DNA 洗涤 DNA 洗涤液使用前按要求加入无水乙醇，使其成为合格的 DNA 洗涤液，否则造成DNA 柱上流失，大大降低其浓度。 DNA 洗涤时将洗涤液静置时间应严格控制， 保证洗涤液与核酸有充分的反应时间，提高标本 DNA 洗涤效果。

　　3.3.3 DNA 洗脱 洗脱液 pH 不合适，将会减少 DNA提取效率，应确保洗脱液 pH 值在 7.0~8.5 之间。 为了提高 DNA 洗脱效率，可在加入洗脱液后在室温静置至少 3min 以上，肿瘤细胞偏少应 5min 以上，再按要求离心。 加入洗脱液量可根据我们病理评估及基因检测要求量的结果适度加减，超过 200μl洗脱体积所得的 DNA 浓度会降低， 但 DNA 总量不会减少。 建议活检小标本 DNA 洗脱液体积应小于 100μl.

　　4 DNA 定量
　　
　　提取的 DNA 应经过定量以保证足够适量的DNA 含量用于下游突变检测。 DNA 提取后应立即进行 DNA 浓度测定，随后存储 DNA 样本。 可利用分光光度计在 260nm 处光密度值和银光染料法DNA 总量检测 ,OD260nm/OD280nm比值可直观判断基因的纯度，一般值为 1.8~2.0 较好，该方法较简便，但无法评估可扩增的 DNA 片段和 PCR 抑制物。若DNA 含量的确不符合检测要求应终止进一步检测，以节约成本和时间。

　　综上所述， 在病理石蜡标本基因检测 DNA 提取中，我们应尽量了解每个步骤的作用以及学会如何控制石蜡标本 DNA 提取的关键点， 这是对石蜡标本基因检测的操作者必备要求，也是如何防止假阳性假阴性结果的出现而采取了质量保证措施，同时也是我们病理科开展基因检测项目前提[8].

　　参考文献
　　
　　[1] 中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组。中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识[J].中华病理学杂志，2011,40（10）：700-702.
　　[2]卫生部病理质控与评价中心，结直肠癌 KRAS 基因突变检测专家组。中国结直肠癌 KRAS 基因突变检测专家共识[J].中华病理学杂志，2012,41（9）：635-636.
　　[3]李丹，刘亚丽，刘静，等。石蜡组织存放时间对提取 DNA 质量的影响[J].河南大学学报（医学版），2014,33（1）：9-13.
　　[4]陈顺平。FISH 中酶消化细胞的几点体会[J].临床与实验病理学杂志，2010,26（1）：116-117.
　　[5]Sengüven B, Baris E, Oygur T,et al. Comparison of methods for theextraction of DNA from formalin -fixed, paraffin -embeddedarchival tissues[J]. Int J Med Sci,2014,11（5）：494-503.
　　[6]王卡娜，李红芳，杨爱宏。等。石蜡包埋组织中 DNA 提取方法的比较[J].中国实验诊断学，2009,13（6）：753-756.
　　[7]张玲玲，刘月平，王永军，等。石蜡包埋组织基因组 DNA 提取的条件优化[J].临床与实验病理学杂志，2011,27（9）：1021-1023.
　　[8]李金明。实时荧光 PCR 技术[M].北京：人民军医出版社，2009:383.