红叶杨与竹柳抗寒实验的材料与方法

　　2 材料与方法。

　　2.1 试验地概况。

　　试验地坐落于河北省保定市河北农业大学西校区园林与旅游学院，位于华北平原中心地带、河北省中部，冀中平原西部，北纬 39°10′-40°20′，东经 113°30′-115°20′之间。年平均气温可达 12℃，年降水量达到 550mm 左右，主要集中在每年的 7 至 8月份，占全年总降水量的 50%以上。保定具有温带湿润性气候特征，春季干旱少雨并经常出现大风天气；夏季炎热，气温较高并经常出现雨水天气并且降水量较大；秋季凉爽并且较为干燥；冬季气温较低偶尔伴随少量降雪，四季特点区分较为明显。年平均气温差距较大，在最冷时期，平原的平均气温为-3℃左右，山区的平均气温达到了-13℃左右。最热时期的平均气温差距较小，平原地区达到了 27℃，山区平均气温为22℃[81].

　　2.2 试验材料和方法。

　　试验材料均来自河北农业大学苗圃基地，以红叶杨、竹柳的枝条及根系作为试验材料。试验在 2012 年 11 月下旬进行，选择栽培管理条件和生长状况基本相同的一年生红叶杨和竹柳，剪取中部外围长 20~25cm 左右的枝条，根据试验要求挑选整齐均匀、粗细一致的枝条[82].选取粗细一致的红叶杨和竹柳的根系，剪成 5cm 长的小段。

　　将红叶杨和竹柳的枝条以及根系先用自来水冲洗一遍，将试验材料表面污垢清除干净，再用蒸馏水进行第二次冲洗[83].将经过两次冲洗的试验材料用干燥的滤纸吸净表面的水分。处理好的红叶杨和竹柳的枝条以及根系用石蜡将两端密封后用聚乙烯袋包装[84].

　　将放置于聚乙烯袋中的红叶杨和竹柳的枝条以及根系平均分成 6 组，放入冰箱中进行低温处理。设定的温度梯度分别为：-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃，以不进行低温胁迫处理的枝条和根系为对照组。首先将红叶杨和竹柳的枝条以及根系置于 4℃下进行预冷处理 8h,然后将温度调降至 0 ℃并保持 4h[85].将所有试验材料从0℃开始降温，每次降温 5℃，每组供试材料分别降至设定温度后停留 24h.然后将经过低温胁迫处理后的试验材料样本置于 0~5℃的冰箱内化冻 5h 后放置于恒温状态下恢复 4 h 进行待测[86].

　　2.3 指标测定方法。

　　2.3.1 相对电导率测定方法。

　　当植物体处于低温胁迫过程中时，细胞膜会因低温受到损伤，进而导致功能受损、膜透性增大，并逐渐渗出电解质。置于去离子水的植物因电解质的外渗导致电导增加。

　　因此，根据电导仪测定液体的电导增加值可判断植物受低温的伤害程度[87].称取经不同低温处理后的红叶杨和竹柳枝条以及根系各 2g,放入 100ml 三角瓶中，并加入蒸馏水 40ml,将材料完全浸于水中，之后抽出空气，并放入 25℃恒温箱里 10h,然后取出三角瓶进行均匀摇动，用 DDS-11c 型电导仪检测此时溶液的电导值，所得数据为煮沸前的电导值 E1,将三角瓶放入沸水浴中 10min,取出后恢复至室温，测定其电导值 E2,即得煮沸后电导值[88].红叶杨和竹柳的枝条以及根系的相对电导率按以下公式进行计算分析：相对电导率（%）=E1/E2×100%[89]

　　2.3.2 丙二醛（MDA）含量测定方法。

　　分别称取经剪碎处理的的红叶杨和竹柳的供试材料各 0.5g,分别放入经过预冷处理的研钵中，然后添加 5%的三氯乙酸（TCA）试剂 2ml,并往研钵中酌量加入一定数量的石英砂以便将试验材料充分研磨[90].当研磨后的物质呈均浆状态时倒入离心管，再往研钵中加入 8ml 的三氯乙酸（TCA），将经过充分洗涤过的研钵内物质倒入离心管。

　　将装有经过处理物质的离心管放在 3000r/min 离心机上进行离心 20min,并用量筒量其上清液体积记为 V.选择规格统一的试管，并往试管中用移液管分别加入 2ml 的经过离心的上清液，然后加入 2ml 0.6%的硫代巴比妥酸（TBA）溶液，并将溶液充分混合均匀，然后将装有各试验材料上清液的试管放入恒温水浴锅中加热 15min,之后将加热过后的试管拿出水浴锅，等到冷却后，放入离心机进行第二次离心，制取上清液，利用光度仪测定 3 种不同波长的吸光度值[91].用下列公式计算丙二醛（MDA）浓度：C=6.45×（A532-A600）-0.56×A450丙二醛（MDA）含量 （mMol/g）=CV/100（其中 A450、A532、以及 A600分别表示试验待测溶液中丙二醛（MDA）在波长分别为 450nm、532nm 以及 600nm 处的吸光度值）

　　2.3.3 可溶性蛋白质含量测定方法。

　　试验材料中可溶性蛋白的测定采用考马斯亮蓝-G250 法。考马斯亮蓝在游离状态下显红色，其最大光吸收在 465nm.当其处在酸性溶液中与蛋白质结合后显青绿色，最大光吸收在 595nm.因此，可根据色素结合物在 595nm的光吸收值检测蛋白质的量[92].

　　首先进行配取蛋白质标准溶液（100 ug. ml-1）：称取牛血清白蛋白 0.1g,并用少量蒸馏水溶解，然后定容至 1L,将溶液放置冰箱中进行保存。

　　考马斯亮蓝-G250 溶液配取过程：称取考马斯亮蓝-G250 100mg,加入 90%乙醇50ml,再加入浓度为 85%的 H3PO4100ml,然后添加蒸馏水定容至一升，将溶液在常温下放置 30 天[93].

　　蛋白质含量为 0-100?g/ml 标准曲线溶液的制取过程：分别准备 6 支试管，按表中所示配制 0-100?g/ml 的牛血清白蛋白质液各 1ml,分别往每支试管中加入 5ml 考马斯亮蓝-G250 试剂，将溶液摇匀以充分混合、并在常温下放置 2min[94].分别以蛋白质浓度和吸光度值为 x,y 轴制作蛋白质标准曲线，如下表所示。

　　试验样品提取：分别提取红叶杨和竹柳的试验样品0.5g,剪碎后加入 5ml 缓冲液和少量石英砂进行充分研磨。吸取经处理过的样品提取液1.0ml 放入试管中（每个试验测试材料分别准备三次重复），然后添加5ml 考马斯亮蓝反应液，并混合均匀，等待静置2分钟后在595nm 下进行比对，记录吸光度值，并按照标准曲线提供的数值查取蛋白质含量[95].

　　2.3.4 可溶性糖含量测定方法。

　　采用蒽酮乙酸乙酯法对试验材料中的可溶性糖含量进行测定。植物体内的糖在与浓硫酸反应中脱水转变成糠醛，其余苯酚缩合成一种橙色化合物，可根据其在 10~100mg 范围内的颜色判断糖的含量[96].因在 485nm 波长下具有最大吸收值，可根据比色法测定。将 100mg 无水葡萄糖放入 100ml 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度处并稀释 10 倍[97].制作葡萄糖标准曲线：取 6 支试管，按表中数据加入各种试剂，并摇匀，放在沸水浴中煮沸 1min,取出后冷却至室温，用分光光度计在 630nm 波长处比色，记录光密度，制作标准曲线，并求出标准线性方程（如表 2）。

　　采用蒽酮法测定可溶性糖含量：分别称取 0.5g 红叶杨和竹柳的试验样品，添加10ml 蒸馏水，使用塑料薄膜封口，放入沸水浴 30min,并反应 3 次，将反应液滤入50ml 容量瓶中，并多次清理试管，定容至刻度。使用试管添加提取液 0.5ml 并三次重复，注入 1.5ml 蒸馏水，再加 0.5ml 蒽酮乙酸乙酯试剂和 5ml 浓 H2SO4,经充分振荡后，立即加入沸水浴保温 1min,然后取出冷却至室温，以空白作对比，在 630nm 处比色，并详细记录数值。根据下列公式求出反应液含糖量[98].

　　2.3.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法。

　　采用 NBT 光还原法对试验材料中超氧化物岐化酶（SOD）活性进行测定。试验药剂中的核黄素可被光还原，当其处在有氧条件下可再度氧化，且在 560nm处具有最大吸收值[99].而超氧化物歧化酶对氮蓝四唑的抑制作用确定超氧化物歧化酶的活性大小。当光还原反应后，根据反应液颜色的深浅可说明酶活性的高低。

　　选取 5ml 试管 7 支（3 支作为试验测定管，4 支作为试验对照管），按试剂配制表依次加入。选取 1 支对照管安排在不向光的地方，剩余安排在 4000lx 处理条件下反应 20min.

　　2.3.6 过氧化物酶（POD）活性测定方法。

　　采用愈创木酚法对试验材料中的过氧化物酶（POD）活性进行测定。普遍存在于植物体内的过氧化物酶（POD）具有较高的活性，并且在植物体内的重要作用影响着植物的正常生长[100].因此，根据过氧化物酶活性变化反映低温对植物体代谢的影响。试验中的愈创木酚在 470nm 处吸光度值达到一定峰值，并且在被氧化的过程中颜色逐渐变深直到棕色。因此，测量 470nm 的吸收值可进一步反映过氧化物酶活性[101].分别称取红叶杨和竹柳的枝条以及根系 1g,并将称得的试验材料剪碎。然后加入 3ml pH=7.8 的磷酸缓冲液，将试验材料放入研钵中添加少量石英砂进行充分研磨成浆状，并放入离心机进行 4000r/min 离心 20min,将获取的溶液放置于阴暗处。

　　2.3.7 枝条恢复生长测定方法。

　　对以上 6 个试验指标测试完毕后进行红叶杨和竹柳枝条的恢复生长试验。将经过不同低温胁迫处理的红叶杨和竹柳枝条呈自然生长状态放置（每个温度胁迫处理分别准备 15 根枝条），将枝条下端的封口石蜡去除，并将其剪成马蹄状，注意将所有枝条修剪一致。将修剪好的各组枝条每 5 根放入烧杯中，之后往烧杯中注水直到没过枝条底端，并保持烧杯内水量一致。然后将所有材料放入温度在 23℃以上的组培室中，并进行光照补充。根据烧杯内存水情况，每隔 3 至 5 天进行换水。四周后观察红叶杨和竹柳的枝条萌芽情况，并进行数据统计。

　　2.4 数据处理方法。

　　对于试验原始数据的合成、统计以及图表制作使用 MicrosoftExcel 以及Word2003;数据统计分析采用 SPSS13.0 统计分析软件完成。