中医药对EB感染及所造成免疫损伤的治疗作用

　　EB 病毒 ( Epstein-Barr virus,EBV) 属于 γ - 疱疹病毒家族,广泛存在于人群,90%的人建立了终身潜伏状态感染,它与我国高发的鼻咽癌存在密切关系[1].

　　在儿童时期 EBV 感染可直接导致传染性单核细胞增多症,进一步发展还可致恶性疾病,并与自身免疫性疾病相关[2,3].由于 EBV 具有广泛的致病,及对人体免疫系统的影响,对其研究日益增多.有研究表明中医药治疗 EB 病毒感染具有一定优势[4].本研究采用随机对照观察的方法,从临床症状、病毒复制、抗体转化及对免疫细胞、抗体的影响对中医药治疗近期 EB 病毒感染进行观察,进行 12 周随访,深入了解中医药对EB 感染及所造成免疫损伤的治疗作用,为抗 EB 病毒感染,减少相关恶性及免疫性疾病的发生提供新的依据.

　　资料与方法

　　1 西医诊断标准 参考《诸福堂实用儿科学》EB 急性病毒感染诊断标准: ( 1) 症状或体征至少 3 项以上 阳 性: 发 热; 咽 炎、扁 桃 体 炎; 颈 淋 巴 结 肿大 >1 cm; 肝脏肿大( 4 岁以下 > 2 cm,4 岁以上可触及) ; 脾脏肿大( 可触及) .( 2) 血常规检查: 白细胞分类淋巴细胞 >50%或淋巴细胞总数 > 5 × 109/ L.( 3)EB 病毒特异性抗体及 EB 病毒-DNA 检测: 具备以下任一项: EBV-CA-IgM 抗体阳性; 双份血清 EBV-CA-IgG 抗体滴度 4 倍以上升高; EBV-EA 抗体一过性升高; EBV-CA-IgG 抗体阳性且呈低亲和力,和 ( 或)EBV-CA-IgG 抗体阳性( ≥1∶ 2 560) 呈高亲和力; EBNA抗体后期阳性; EB 病毒 DNA 阳性.

　　2 中医辨证标准 参考《实用中医儿科·传染性单核细胞增多症》: ( 1) 邪郁肺卫证主症: 发热,微恶风寒; 咽痛,咽部红肿; 眼睑或面部浮肿; 颈部痰核初起,质软压痛; 次症: 头身疼痛,有汗,咳嗽,鼻塞,流涕,小便大便正常; 舌红,苔薄黄或薄白,脉数.( 2) 痰瘀热结证主症: 持续发热; 面色红赤,唇红,口渴不喜饮或饮后呕吐,烦躁不安; 咽部红肿可见白脓样物; 颈等多处痰核,肿大,质稍硬,触痛明显; 腹大,可触及症瘕痞块,有触痛; 次症: 咽痛,可见皮疹色红,食欲减退,小便短赤,大便干结,或溏稀不爽; 舌红或绛,苔黄白厚,脉洪数或滑数.( 3) 正虚邪恋证主症: 体温低热,微烦,咽部轻度红肿,咽干,口渴; 次症: 颈部痰核未消,轻压痛,腹部仍可及症瘕痞块,无触痛,腹胀食少,多汗,乏力; 舌红,苔少或白,脉细数或滑数.符合主症 3 条以上加舌脉即可诊断.

　　3 纳入标准 ( 1) 1 ~ 18 岁; ( 2) 病程在 1 个月内; ( 3) 符合 EBV 感染的西医诊断标准及中医辨证分型标准; ( 4) 监护人签署知情同意书.

　　4 排除标准 ( 1) 接受过激素及其他免疫抑制剂治疗; ( 2) 合并病毒相关噬血等严重血液系统损害及恶性病变者; ( 3) 合并心、肾功能不全及神经系统损害者; ( 4) 纳入后服药期间出现不良反应不能继续用药者.

　　5 一般资料 本研究对象来源于 2008 年 9 月-2012 年 3 月北京儿童医院中医科内综一病房住院患儿,共计 81 例.随机分为治疗组和对照组( 两组 4∶ 3建立随机表) .治疗组46 例,男27 例,女19 例,年龄1~ 16 岁,平均 ( 6. 88 ± 3. 28 ) 岁; 对照组 35 例,男 21例,女 14 例,年龄 1. 5 ~17 岁,平均( 6. 68 ± 3. 87) 岁.

　　治疗组中发热34 例,皮疹5 例,眶周水肿7 例,鼻塞30例,咽峡炎 40 例,扁桃体肿大 35 例,淋巴结肿大 44例,肝肿大 34 例,脾肿大 17 例,肺炎8 例,心脏扩大 2例,脑电图异常 1 例,蛋白尿 15 例,血尿 5 例,EBV-DNA 阳性 40 例,EBV-CA-IgM 阳性 45 例,EBV-NA-IgG阳性2 例.对照组中发热27 例,皮疹3 例,眶周水肿6例,鼻塞 22 例,咽峡炎 33 例,扁桃体肿大 31 例,淋巴结肿大 32 例,肝肿大 24 例,脾肿大 14 例.肺炎 6 例,心脏扩大 3 例,脑电图异常0 例,蛋白尿 14 例,血尿 4例,EBV-DNA 阳性 31 例,EBV-CA-IgM 阳性 35 例,EBV-NA-IgG 阳性 2 例.两组年龄及合并症比较,差异无统计学意义(P >0. 05) .

　　6 治疗方法 治疗组给予中药汤剂( 药物采用北京人民卫生中药饮片厂生产) ,每天1 剂,水煎服,每天分 2 次口服,患者体重 <20 kg 时,100 mL/次; ≥20kg 时,200 mL / 次.( 1) 邪郁肺卫证( 早期) : 治法: 疏风清热,祛痰散结; 方药: 鲜芦根 15 ~ 30 g 银花 10 g连翘 10 g 丹皮 10 g 生石膏 15 ~30 g 薄荷 6 g僵蚕 10 g 栝蒌 15 g 夏枯草 10 g 焦山楂 10 g 黄芩6 g 炒栀子6 g.( 2) 痰瘀热结证( 极期) : 治法: 清热解毒,化痰散瘀; 方药: 鲜芦根15 ~30 g 青黛 3 g紫草 10 g 黄芩 10 g 薏苡仁 15 g 连翘 10 g 僵蚕6 g 丹皮 10 g 败酱草10 g 生石膏 30 g 柴胡 10 g郁金 10 g 蒲公英 10 g 夏枯草 10 g 桔梗 9 g.( 3) 正虚邪恋证( 恢复期) : 治法: 清热散结,养阴生津; 方药: 鲜芦根15 ~30 g 青蒿 10 g 鳖甲 10 g 连翘 10 g 鲜茅根 15 ~30 g 丹参 10 g 贝母 10 g 郁金 10 g 生牡蛎 15 ~ 30 g 炒栀子 6 g 生地 10 g.

　　随证加减: 鼻塞流涕加白芷 10 g,辛夷 10 g,苍耳子 4g; 咽痛重加牛蒡子 10 g; 咳嗽加杏仁 10 g,前胡 10 g,枇杷叶 15 g; 皮疹加青黛3 g,紫草 10 g; 腹部症瘕痞块加丹参10 g,鳖甲 10 g,泽兰 10 g; 痰核肿痛明显加生牡蛎 15 g,浙贝母 10 g,乳香 3 g; 黄疸加茵陈 10 g,金钱草 15 g.对照组方案: 更昔洛韦注射液( 每支 200mg,湖北科益药业股份有限公司,批号: 090403 - 255)5 ~ 10 mg / ( kg·d) ,静脉滴注,分 2 次,连用 2 周; 匹多莫德口服液( 每支 0. 2 g,普利化学工业公司,批号:B090364) 0. 2 g / 次,口服,每日 2 次.两组疗程为2 周,于治疗后进行临床疗效判定,疗程结束后随访至12 周.

　　7 观察指标及方法 治疗前后及随访第 4、12 周进行观察检测.

　　7. 1 临床疗效 观察检测发热、咽痛时间、淋巴结和肝脾肿大等临床症状及体征.

　　7. 2 异形淋巴细胞数量、免疫球蛋白、淋巴细胞亚类变化情况 应用流式细胞仪检测患者异常淋巴细胞数量、免疫球蛋白、淋巴细胞亚类( 具体为: CD3+、CD4+、CD8+、B 细胞及 NK 细胞百分比) 变化情况.

　　7. 3 淋巴结情况 应用颈部 B 超观察颈部淋巴结情况,腹部 B 超了解肝脾及腹腔淋巴结情况.

　　7. 4 EB DNA 转阴例数 在治疗前后及随访的第 4、12 周,病房取血后送北京爱普益科技有限公司检测采用美国 Bio-Rad 公司荧光定性 PCR 扩增仪,中山大学达安基因股份有限公司提供 EBV 核酸扩增荧光定量检测试剂盒,严格按照试剂盒说明操作,测定 EBDNA 转阴例数.

　　7. 5 EBV-CA-IgM 转阴例数及 EBV-NA-IgG 转阳例数 病房取血后由北京儿童院病毒室根据实验操作及结果判定按说明书操作,采用德国欧蒙公司抗 EBV抗体试剂盒,应用间接免疫荧光法进行测定 EBV-CA-IgM 转阴例数变化情况及 EBV-NA-IgG 转阳例数的变化情况.

　　7. 6 不良反应及随访情况 在治疗及随访期间,记录不良反应,血、尿常规,心、肝、肾功能等.

　　8 疗效判定标准 参考《中医病证诊断疗效标准》制定[7].临床痊愈: 症状、体征消失,无其他并发症出现,临床实验室检查各项指标恢复正常,疗效指数≥90%; 显效: 症状、体征明显减轻,无其他并发症出现,临床实验室检查各项指标明显比较,疗效指数在60% ~ 80% 之间; 有效: 症状、体征减轻,无其他并发症出现,临床实验室检查各项指标好转,疗效指数在30% ~ 59% 之间; 无效: 症状、体征无明显改善或有并发症出现,临床实验室检查各项指标无明显变化,疗效指数 <30%.疗效指数的计算公式( 尼莫地平法) : 疗效指数( %) = [( 治疗前积分 - 治疗后积分) /治疗前积分]×100%.

　　9 统计学方法 应用 SPSS 11. 5 软件进行统计学分析,计量资料以x ±s 表示,采用t 检验,方差分析;不符合正态分布用秩和检验; 计数资料采用 χ2检验.P < 0. 05 为差异有统计学意义.

　　结 果

　　1 治疗后疗效情况比较 治疗组: 临床痊愈 11例 ( 23. 9%) ,显 效 28 例 ( 60. 8%) ,有 效 5 例( 10. 9%) ,无效 2 例( 4. 4%) ,总有效率 95. 6%.对照组: 临床痊愈 7 例( 20. 0%) ,显效 17 例( 48. 6%) ,有效 9 例 ( 25. 7%) ,无 效 2 例 ( 5. 7%) ,总 有 效 率94. 3% .治疗组总有效率高于对照组,但两组比较差异无统计学意义(P >0. 05) .

　　2 两组治疗后症状改善情况比较( 表 1) 治疗组其退热时间、咽充血持续时间,扁桃体肿大持续时间均短于对照组,淋巴结肿大及肝肿大消退上优于对照组,差异有统计学意义(P < 0. 05) .在咽痛时间虽短于对照组,差异无统计学意义(P >0. 05) .

　　3 两组治疗前后异常淋巴细胞、ALT、AST、免疫球蛋白改善情况比较( 表 2) 治疗组治疗前后及随访 4、12 周异常淋巴细胞阳性例数分别为 45、17、8 和 1 例,对照组则分别为32、25、10、7 例.治疗后及随访4、12 周与治疗前比较,两组末梢血常规异型淋巴细胞阳性例数均明显减少(P <0. 01) ; 两组免疫球蛋白 IgA 和 IgM 表达下降(P <0. 05,P <0. 01) .治疗后及随访 4、12 周时与本组治疗前比较,治疗组中IgG 亦明显下降(P <0. 05,P< 0. 01) ,而对照组中 IgG 仅治疗后与治疗前比较下降(P <0. 05) ; 同时治疗组 AST、ALT 及对照组 AST 亦明显改善(P <0. 05) .与对照组比较,治疗组治疗后及随访4、12 周异常淋巴细胞阳性例数减少明显,差异有统计学意义(P <0. 05) .治疗前后及随访 4、12 周时 AST、ALT及各免疫球蛋白两组间比较,差异无统计学意义(P >0. 05) .

　　4 两组患者淋巴细胞亚类改善情况比较( 表 3)治疗后及随访 4、12 周时与本组治疗前比较,两组CD3+、CD8+均明显下降,CD4+、CD4/CD8 及 B 细胞均明显上升,差异有统计学意义(P < 0. 05) .治疗组NK 细胞治疗后及随访 4、12 周时明显高于本组治疗前,并高于对照组,差异有统计学意义(P <0. 05) .

　　5 两组患者 EB DNA、EBV-CA-IgM 及 EBV-NA-IgG 转化例数变化情况比较 ( 表 4) 治疗后及随访4、12 周与治疗前比较,两组 EB DNA 及 EB-CA-IgM 转阴例数均明显增多,差异有统计学意义(P <0. 05) .与对照组比较,治疗组治疗后、随访 4 周 EB DNA 转阴例数及治疗后 EB-CA-IgM 转阴例数均明显增多,差异有统计学意义(P <0. 05) .治疗后两组 EB-NA-IgG 转阳例数治疗前后比较及两组间比较,差异均无统计学意义(P >0. 05) .

　　6 两组随访结果比较( 表 5) 随访 4 周时治疗组在咽充血、淋巴结肿大及异常淋巴细胞例数少于对照组,差异有统计学意义(P < 0. 05,P < 0. 01) .随访12 周治疗组在异常淋巴细胞及肝肿大未恢复例数明显低于对照组,差异有统计学意义(P <0. 01) .

　　7 不良反应及随访情况 治疗中,治疗组未发现明显不良反应,对照组有 3 例出现白细胞减少症,有1 例治疗中肝功异常加重,考虑可能与更昔洛韦有关,停药 10 天后,肝功恢复正常.随访期 4 周治疗组在访 44 例,对照组在访 22 例,失访率 18. 7%,随访 12周治疗组 在 访 22 例,对 照 组 在 访 19 例,失 访率 50. 6%.

　　讨 论

    EBV 感染是儿童期常见的病毒感染之一,它可以累及全身多个系统,包括肝、脾、淋巴结、肾、心脏、肺、骨髓、脑等[2],而且症状多变,病情轻重不一,但以网状内皮系统病变为主,可以出现典型的传染性单核细胞增多症( IM) 及其他复杂的临床表现或隐性感染[8].寻找治疗 EB 病毒感染的有效方案,改善预后具有重要的意义.

　　EB 病毒感染导致的发热,咽喉红肿,全身淋巴结及肝脾肿大等表现,属中医学"温病"范畴,小儿脏腑娇嫩,形气未充,气血未足,容易感受外邪,本病为感受温热疫毒,从口鼻而入,毒热入里,热灼津液,加之小儿脾胃虚弱,脾失健运则痰浊内生,胃阴不足则助热上炎,则毒热痰火相互胶结,痰火郁积外发则发热,上攻咽喉则见咽部红肿热痛,痰热互结,阻滞经络气血,气血壅塞瘀滞难以消散则出现痰核,症瘕.痰热壅肺,肺气闭郁,则咳嗽喘促.热毒内窜营血,则发为斑疹.可见毒热炽盛,气血壅塞,痰热瘀结,充斥脏腑,流注经络,导致腑败脏衰是本病基本病机.笔者针对不同病程,以疏风解表,清热解毒,化痰散瘀,生津护阴为治则,采用口服中药治疗 EB 病毒急性感染取得了较好疗效,结果显示中药组总有效率 95. 6%,与静脉滴注抗疱疹病毒药物更昔洛韦( 总有效率 94. 3%) 比较疗效相当,而临床症状的恢复如退热时间、咽充血持续时间,扁桃体肿大持续时间均短于对照组,淋巴结肿大及肝肿大消退上亦优于对照组提示中药口服治疗 EB 病毒感染对临床症状缓解具有较好的临床疗效.

　　研究显示 EB 病毒感染后传染性单核细胞增多症患者的 DNA 载量负荷明显低于 EB 病毒相关噬血细胞综合症及慢性活动性 EB 病毒感染的患者,提示降低DNA 载量,可以减少 EB 病毒感染后不良并发症和改善预后[9,10].EB-CA-IgM 抗体多出现于病毒感染早期,由急性原发感染进人潜伏感染EB 病毒NA-IgG 呈现阳性,在慢性活动性 EB 病毒感染的患者 NA-IgG 不能阳转可能是因其不能进入潜伏状态引起,EB 病毒感染后的抗体转化与病毒感染预后亦相关[10,11].现代药理研究显示夏枯草提取物可以抑制 EB 病毒诱导的淋巴瘤 Raji细胞增殖,诱导基因凋亡[12]; 青黛、黄芩等在体外为 EB病毒抗原具有杀伤作用[13],这些提示了中药对 EB 病毒抑制作用的部分机制.本研究结果中中药治疗后及随访4 周 EB 病毒 DNA 转阴例数及治疗后 EB-CA-IgM 抗体阴转例数明显多于对照组,提示中医治疗可能有促进EB 病毒 DNA 载量转阴及特异性抗体转化,进而改善了EB 病毒感染预后的作用.

　　EB 病毒感染机体后,首先感染 B 淋巴细胞,产生病毒血症,并进一步累及全身淋巴组织及具有淋巴细胞的组织内,使 T 细胞被刺激而增殖,导致全身性淋巴结肿大及内脏器宫受累.CD4+T 淋巴细胞产生 T 辅助细胞 1 型( Th1) 的细胞因子,从而激活 NK 细胞和CD8T 淋巴细胞,产生 EB 病毒特异性细胞毒 T 淋巴细胞 ( CTL) ,从而吞噬和消灭 EB 病毒感染的 B 淋巴细胞,使临床表现逐渐消退[14].有学者认为 EB 病毒感染导致的传染性单核细胞增多症的发病过程是免疫控制的结果,而不是病毒复制直接引起的,病情的严重程度与感染的 B 淋巴细胞数量和体内细胞免疫功能强弱有关[15,16].由此可见 EB 病毒造成的免疫紊乱,以及自身免疫功能的强弱对于本病的发生发展起着至关重要的作用.所以,免疫干预治疗不仅对缓解急性感染期临床症状具有重要作用,而且有助于抑制感染引起的免疫紊乱,促进机体免疫恢复,防止 EBV 相关恶性增殖性疾病的发生.NK 细胞在病毒感染早期具有清除感染细胞的作用,并释放 γ - 干扰素,α - 干扰素扩大和增强机体的抗病毒能力[17].同时 NK 细胞升高与病毒载量降低相关,与传染性单核细胞增多症的严重程度呈反比[18].现代药理研究证实: 黄芩有增强细胞吞噬功能并促进淋巴细胞转化,能增强网状内皮系统的吞噬功能,使 NK 细胞活性增强,增强机体非特异性免疫力和机体的抗病能力[19]; 紫草、乳香、丹参、郁金等活血化瘀药既可以抑制机体 T 淋巴细胞所引起的广泛毒性效应,减轻免疫炎症反应,还可以促进机体非特异性免疫,不同程度的改善局部循环,改善毛细血管活性,减少炎症渗出,促进炎症吸收,拮抗病毒感染,改善和调节免疫功能[20].本研究显示中药治疗后免疫球蛋白及免疫淋巴细胞明显恢复,与对照组比较在恢复时间、程度等方面无差异,提示中药组对感染导致的特异性免疫紊乱的作用与西药无明显区别.本研究显示治疗后治疗组 NK 细胞数量上升,提示中药对非特异性免疫具有一定的增强作用.

　　本研究显示对照组有 3 例出现白细胞下降,1 例在治疗中肝功能出现异常,停用更昔洛韦后恢复.

　　而治疗组则显示了良好的安全性,无上述不良反应发生.本研究由于患者多来自于外地,随访时间长以致随访期失访率较高,因此对于在随访期中药组所显示出的促进肝脾淋巴结恢复,病毒抗体转化及对 NK 细胞的恢复作用还有待进一步的证实.

　　总之,本研究显示中医药治疗 EB 病毒感染不仅可以改善临床症状,而且可降低 EB 病毒 DNA 载量,促进 EB 病毒抗体转化,并且可促进 EB 病毒造成的免疫损伤的恢复,对预防 EBV 相关性疾病的发生、减少EB 病毒感染后发生恶性疾患的风险具有十分重要的意义.

　　参 考 文 献

　　[1] 陈莉,朱远源. 肿瘤研究的新热点---EB 病毒[J]. 肿瘤防治研究,2008,35( 10) : 750 -754.

　　[2] 李中跃,楼金秆,陈洁. 儿童 EB 病毒感染首发症状及相关疾病谱分析[J]. 中华儿科杂志,2004,42( 1) : 20 -22.

　　[3] 陆婉秋. 儿童慢性活动性 EB 病毒感染相关疾病谱及临床分析[J]. 现代预防医学,2011,38( 16) : 3196 -3198.

　　[4] 孙雪颖,梅全喜,周小军. 中药的抗 EB 病毒作用研究进展[J]. 中药材,2008,31( 2) : 320 -322.

　　[5] 胡亚美,江载芳主编. 诸福棠实用儿科学[M]. 第 7 版.北京: 人民卫生出版社,2012: 821 -825.

　　[6] 江育仁主编. 实用中医儿科·传染性单核细胞增多症[M]. 上海: 上海科学技术出版社,1995: 366 -372.

　　[7] 中医病证诊断疗效标准编审委员会. 中医病证诊断疗效标准[S]. 北京: 国家中医药管理局,1994: 37.

　　[8] 易志刚. EB 病毒感染致病机制的研究进展[J]. 四川解剖学杂志,2009,17( 3) : 35 -37.

　　[9] 黄志卓,谢正德,闫静,等. EB 病毒相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症患儿的 EB 病毒感染特征[J]. 实用儿科临床杂志,2012,27( 3) : 181 -183.

　　[10] Teramura T,Tabata Y,Yagi T,et al. Quantitative analysisof cell free Epstein-Barr virus genome copy number in pa-tients with EBV associated hemophagocytic lymphohistiocyto-sis[J]. Leuk Lymphoma,2002,43( 1) : 173 - 179.

　　[11] Kinwra H,Hoshino Y,Kanegane H,et al. Clinical and vir-ologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus in-fection[J]. Blood,2001,98( 2) : 280 - 286.

　　[12] 付晓瑞,张明智,刘宏民,等. 夏枯草提取物对人淋巴瘤Raji 细胞增殖的影响及机制探讨[J]. 山东医药,2008,48( 24) : 20 - 22.

　　[13] 刘小红,叶树清,张忠浩,等. 热毒净在体外对 EB 病毒抗原表达的抑制作用[J]. 中国实验方剂学杂志,2007,13( 10) : 62 - 63.

　　[14] 叶中绿,庞伟君,黄秀兰. EB 病毒感染患儿细胞因子水平与 T 细胞亚群检测的临床意义[J]. 现代预防医学,2008,35( 12) : 2306 - 2308.

　　[15] 孙建军,卢洪洲. 传染性单核细胞增多症的研究进展[J]. 诊断学理论与实践,2009,8( 2) : 205 -207.

　　[16] 胡晨曼,孙梅. EB 病毒感染及其免疫反应[J]. 国际儿科学杂志,2010,37( 1) : 33 -35.

　　[17] Stefan H. E. Kaufmann,Alan Sher 主编,朱立平翻译. 感染性疾病免疫学[M]. 北京: 化学工业出版社,2005: 103- 104.

　　[18] Williams H,MeAulay K,Macsween KF,et al. The immuneresponse to primary EBV infection: a role for natural killcells[J]. Br J Haematol,2005,129( 2) : 266 - 274.

　　[19] 王振刚,周金黄主编. 中药药理与临床研究进展[M]. 北京: 中国科学技术出版社,1992: 254 -261.

　　[20] 高冲,刘璐,胡爱菊,等. 活血化瘀中药的药理作用研究进展[J]. 药物评价研究,2013,36( 1) : 64 -68.