双醋瑞因胶囊有关物质的HPLC法测定分析

　　摘    要：　目的 建立测定双醋瑞因胶囊有关物质的高效液相色谱 (HPLC) 法。方法 色谱柱采用Kromasil C18柱 (250 mm×4. 6 mm, 5μm) ，流动相为醋酸溶液 (取水1 000 m L，用醋酸调节pH至2. 5) -甲醇-乙腈 (35∶45∶20, V/V/V) ，检测波长为254 nm，流速为1. 0 m L/min，柱温为30℃，进样量为20μL。结果 大黄酸与双醋瑞因线性回归方程分别为A大=83 963 C大-787. 71 (r=0. 999 9, n=7) , A双=6 110 430 C双+342. 29 (r=1. 000, n=8) 。双醋瑞因进样质量浓度在0. 04～2. 02μg/m L范围内与峰面积线性关系良好。结论修订系统适用性试验要求，用含双醋瑞因、单乙酰大黄酸Ⅰ、单乙酰大黄酸Ⅱ和大黄酸的峰识别对照品为参比物，以相对保留时间作为系统适用性要求和峰识别依据。该方法使用的色谱柱范围较广，出峰顺序不因色谱柱及流动相比例的改变而改变，分析时间短，效率高，各杂质峰更易分离，易于辨识。

　　关键词：　双醋瑞因; 有关物质; 高效液相色谱法; 质量控制;

　　Abstract：　Objective To establish an HPLC method for content determination of related substances in Diacerein Capsules. Methods The chromatographic column was Kromasil C18 column ( 250 mm × 4. 6 mm, 5 μm) , the mobile phase was acetic acid solution ( taking 1 000 m L of water and adjusting its pH to 2. 5 with acetic acid) -methanol-acetonitrile ( 35 ∶ 45 ∶ 20, V ∶ V ∶ V) , the detection wavelength was 254 nm, the flow rate was 1. 0 m L/min, the column temperature was 30 ℃ and the sample size was 20 μL. Results The linear regression equation of rhein was A = 83 963 C-787. 71 ( r = 0. 999 9, n = 7) , and that of diacrein was A = 6 110 430 C + 342. 29 ( r = 1. 000 0, n = 8) . The diacerein showed good linear relationship with peak area in the range of 0. 04-2. 02 μg/m L. Conclusion The system suitability test requirements is revised, the reference substance is identified with the peaks of diacetyl, mono acetyl rhubaric acid Ⅰ, mono acetyl rhubaric acid Ⅱ and rhubarb acid, and the relative retention time is used as the requirement of the system applicability and the basis for peak recognition. This method is applicable for a wide range of chromatographic columns. The order of peaks is not easy to change due to the change of column and flow ratio. The analysis time is short, the efficiency is high, and the impurity peaks are easier to be separated and identified.

　　Keyword：　diacerein; related substance; HPLC; quality control;

　　双醋瑞因 (C19H 12 O 8) 属蒽醌类药物，化学名为4, 5-二乙酰氧基-9, 10-二氢-9, 10-二氧代-2蒽羧酸，主要活性代谢产物为大黄酸[1]，是骨关节炎发病机制中参与重要炎性反应的白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子-α的抑制剂[2,3,4]，具有抗炎、镇痛作用，抑制软骨降解及破骨细胞性骨破坏[5,6,7,8]的作用，用于治疗退行性关节疾病 (骨关节炎及相关疾病) ，可显着改善骨关节炎及相关疾病引起的疼痛和关节功能障碍等。为提高检验效率，参照进口药品注册标准，本试验中采用高效液相色谱 (HPLC) 法测定双醋瑞因胶囊有关物质[9,10,11,12]，修订系统适用性试验要求[13,14,15,16]，结果各杂质出峰顺序不因色谱柱及流动相比例的改变而改变，且杂质峰易分离，便于辨识。现报道如下。

　　1、 仪器与试药

　　1.1、 仪器

　　Waters E2695型高效液相色谱仪，含Empower工作站、Waters 2489型紫外检测器 (美国Waters公司) ;MT-5型电子天平 (百万分之一) 、XS105 DualRange型电子天平 (十万分之一) ，均购于瑞士梅特勒-托利多公司。

　　1.2、 试药

　　样品:双醋瑞因胶囊 (某企业，批号分别为A, B, C) ;峰识别对照品 (某企业，批号为371111，含量为100.5%，含双醋瑞因、单乙酰大黄酸Ⅰ、单乙酰大黄酸Ⅱ和大黄酸) ;大黄酸对照品 (中国食品药品检定研究院，批号为110757-200206，含量为100.00%) ;醋酸 (分析纯) ;二甲基甲酰胺 (DMF, 99.8%，Merck公司，色谱纯) 。
 

　　2、 方法与结果

　　2.1、 溶液制备

　　供试品溶液:避光操作，取装量差异项下粉末，研细，取细粉适量 (约相当于双醋瑞因50 mg) ，精密称定，置50 mL容量瓶中，加DMF 40 mL，超声5 min，振摇使双醋瑞因溶解，加DMF稀释至刻度，摇匀，立即精密量取5 m L，置50 m L容量瓶中，用流动相乙腈-甲醇-醋酸溶液 (20∶45∶35, V/V/V) 稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得 (临用新制) 。

　　对照品溶液:取大黄酸对照品约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加DMF 10 mL溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

　　对照溶液与灵敏度试验溶液:避光操作，精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液;精密量取对照溶液1 mL，置20 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度试验溶液。

　　2.2、 色谱条件与系统适用性试验

　　色谱柱:Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ;流动相:醋酸溶液 (取水1 000 mL，用醋酸调p H至2.5) -甲醇-乙腈 (35∶45∶20, V/V/V) ;检测波长:254 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。理论板数按双醋瑞因峰计应不低于2 000。

　　取峰识别对照品适量，加DMF溶解并稀释成每1 m L约含1 mg的溶液，精密量取，加流动相稀释成每1 mL含10μg的溶液，量取20μL，注入液相色谱仪，精密量取灵敏度试验溶液20μL，注入液相色谱仪，双醋瑞因峰的信噪比大于10。再精密量取供试品溶液、对照溶液和对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪测定，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。各组分的出峰顺序为双醋瑞因、单乙酰大黄酸Ⅰ、单乙酰大黄酸Ⅱ和大黄酸，相对保留时间分别为1.0, 1.4, 1.8, 2.2 min (图1) 。

　　图1 系统适用性试验高效液相色谱图

　　1．双醋瑞因2．单乙酸大黄酸Ⅰ3．单乙酸大黄酸Ⅱ4．大黄酸

　　2.3、 专属性试验

　　取样品粉末适量 (相当于含双醋瑞因125 mg) ，精密称定，置50 mL容量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液5 m L，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为未破坏样品贮备液。精密移取未破坏样品贮备液2.0 m L共4份，分别置10 m L容量瓶中，分别进行如下处理:加1 mol/L盐酸溶液2.0 mL，室温下放置5 h后，加入1 mol/L的氢氧化钠溶液适量，使之成中性，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤 (酸破坏) ;加1 mol/L氢氧化钠溶液2.0 mL，室温下放置30 min后，加入1 mol/L的盐酸溶液适量，使之成中性，加流动相稀释至刻度 (碱破坏) ;加30%过氧化氢溶液2.0 mL，室温下放置5 h后，加流动相稀释至刻度 (氧化破坏) ;放于光照强度为4 500 lx的实验箱中，室温下放置24 h后，加流动相稀释至刻度 (光照破坏) 。另外，取双醋瑞因胶囊内容物 (约相当于双醋瑞因125 mg) ，精密称定，放于密封的耐高温玻璃小瓶中，置80℃高温6 h，取出，放冷，转移至50 mL容量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀 (高温破坏) 。精密量取上述条件处理溶液5 mL，分别置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。详见图2。

　　图2 专属性试验高效液相色谱图

　　A．酸破坏B．碱破坏C．氧化破坏D．光照破坏E．高温破坏

　　可见，酸、碱、氧化、光照、高温破坏条件下降解产生的杂质峰不干扰主成分峰，主成分峰均一，色谱峰纯度大于990，峰纯度符合要求，无杂质峰与主成分一起洗脱。结果表明，双醋瑞因在光照、碱性条件下降解较明显，酸、高温、氧化条件下较稳定。样品记录色谱图至3倍主峰保留时间后无超过0.05%限度的降解杂质峰出现，在进行有关物质检查时样品记录色谱图至3倍主峰保留时间是合适的。同时也表明，本方法可稳定地检测样品所发生的降解变化，方法专属性强。

　　2.4、 方法学考察

　　线性关系考察:取大黄酸对照品10.104 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加入DMF 10 mL使溶解，加入流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置50 m L容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为大黄酸线性考察溶液 (2.02μg/mL) ;分别量取该溶液适量，置适宜容量瓶中，加流动相稀释成质量浓度分别为1.20, 1.00, 0.60, 0.20, 0.08, 0.04μg/mL的系列线性考察溶液。按拟订色谱条件测定，以质量浓度 (C) 为横坐标、峰面积 (A) 为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A=83 963 C-787.71, r=0.999 9 (n=7) 。结果表明，大黄酸质量浓度在0.04～2.02μg/m L范围内与峰面积线性关系良好。取双醋瑞因胶囊内容物0.262 6 g (平均装量每粒0.246 31 g，含双醋瑞因50 mg) ，精密称定，置50 mL容量瓶中，加DMF至刻度，摇匀;精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度;再取1 mL，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为自身对照线性考察溶液 (双醋瑞因质量浓度为2.13μg/mL) ，分别取该溶液适量，置容量瓶中，加流动相稀释制成质量浓度分别为1.07, 0.64, 0.53, 0.32, 0.11, 0.04, 0.02μg/mL的自身对照系列线性考察溶液。按拟订色谱条件测定，以质量浓度 (C) 为横坐标、峰面积 (A) 为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A=6 110 430 C+342.29, r=1.000 0 (n=8) 。结果表明，双醋瑞因质量浓度在0.02～2.13μg/m L范围内与峰面积线性关系良好。

　　精密度试验:精密量取同一大黄酸对照品溶液，每次进样20μL，重复进样6次，记录色谱图。结果的RSD为0.21% (n=6) ，表明仪器精密度良好。

　　检出限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 确定:经试验，双醋瑞因及大黄酸的最低LOD (S/N=3) 分别为0.006μg/m L和0.017μg/mL, LOQ (S/N=10) 分别为0.02μg/m L和0.058μg/m L。

　　稳定性试验:取同一供试品溶液 (批号C) ，分别于配置后的0, 2.5, 6, 17, 19, 33 h时进样分析。结果随着时间的延长，主成分峰峰面积变化不明显，但单乙酰大黄酸Ⅰ和单乙酰大黄酸Ⅱ随着时间的延长峰面积逐渐增加，在33 h时含量分别由0.08%增加至0.16%、由0.05%增加至0.10%，但未见其他杂质峰增加，表明双醋瑞因在DMF中稳定性较差，应临用现配，立即用流动相稀释。

　　加样回收试验:取大黄酸对照品约5 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加DMF溶解并定容至刻度，摇匀，作为贮备溶液。精密量取该贮备溶液1, 2, 3 mL (比例为50%，100%，150%) ，置加入相应空白辅料的100 m L容量瓶中，每个浓度样品溶液各制备3份，分别进样，记录峰面积，按外标法计算大黄酸含量，并计算回收率。结果见表1。

　　表1 大黄酸回收试验结果 (n=9)

　　2.5、 样品含量测定

　　按拟订色谱条件，对3批样品进行有关物质检查，用自身对照法计算各有关物质含量。结果见表2。

　　表2 3 批样品有关物质检查结果 (%)

　　3、 讨论

　　分别考察了3个不同厂家品牌的色谱柱Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , Agilent HC-C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , GL ODS-3柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ，主峰与已知杂质分离度均大于1.5，按双醋瑞因峰计理论板数均大于3 000，表明本试验中选定的色谱条件下，各组分峰形分离较好，适用于不同品牌C18柱，耐用性较好，满足检验需求。

　　在“药典在线”网上参照2010年版《印度药典》，采用与本方法相同的Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ，流动相为0.2%磷酸溶液-乙腈 (62∶38, V/V) ，检测波长为254 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL，测得单乙酰大黄酸Ⅰ、单乙酰大黄酸Ⅱ、大黄酸的分离度分别为2.273, 2.383, 1.151，分离度较高，结果与本方法基本一致。

　　为考察色谱条件的微小变化对各有关物质测定结果的影响程度，本试验考察了流动相比例 (醋酸水溶液-甲醇-乙腈 (30∶47.5∶22.5, V/V/V) 即水相30%，以及醋酸水溶液-甲醇-乙腈 (40∶42.5∶17.5, V/V/V) 即水相40%及pH (±0.2) 即pH 2.3及p H2.7的变化对测定结果的影响，有关物质测定结果差异不大 (RSD<2.0%) ，均未检出其他最大单个未知杂质峰，表明本试验中选定的色谱条件下，各组分峰形分离较好。

　　本研究中色谱条件采用醋酸溶液 (取水1 000 mL，用醋酸调节pH至2.5) -甲醇-乙腈 (35∶45∶20, V/V/V) 为流动相，各杂质的出峰顺序不易因色谱柱及流动相比例的改变而改变，在使用不同品牌C18柱时无差异，因此适用的色谱柱范围较广，避免因所用色谱柱柱效下降、分离度变差、已知杂质可能发生色谱峰重叠、未知杂质可能被误认为已知杂质而导致杂质误判的情况。同时，修订系统适用性试验要求，用含双醋瑞因、单乙酰大黄酸Ⅰ、单乙酰大黄酸Ⅱ和大黄酸的峰识别对照品为参比物，以相对保留时间作为系统适用性的要求和峰识别依据，方法更清晰、明了;由于该系统条件运行一针的时间短，能有效提高检验效率。

　　综上所述，本试验中建立的系统条件适用于双醋瑞因胶囊有关物质的测定，适用的色谱柱范围较广，各杂质峰易分离，试验效率高，结果准确可靠。

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