不同产地全蝎中多西环素含量的高效液相色谱法分析

　　摘    要：　目的：测定不同产地全蝎中多西环素的含量，研究该动物药材养殖过程中抗生素的使用情况。方法：使用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent C18(柱长250mm，柱内直径4.6mm,填料颗粒直径5μm)；流动相为醋酸铵溶液[0.15mol/L醋酸铵溶液-0.01mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺(100:10:1)，用醋酸调节pH值至8.5]-乙腈(83:17)；流速1.0ml/min;检测波长为280nm;柱温40℃；进样量10μl；共测定6个产地10批样品。结果：10批样品中，来自产地A的4批多西环素含量最高，为2.111-2.364mg/g；其次为产地D的1批，含量0.873mg/g，其余B、C、E、F等地的5批无明显差异，含量在0.003-0.013mg/g之间。结论：本研究所用方法快速、准确、高效，为研究全蝎饲养中的抗生素添加提供了技术支持。

　　关键词 :     全蝎;高效液相色谱;多西环素;

　　Abstract：　Objective: through determination of Doxycycline contents in Scorpio of different origins, to investigate antibiotic usage in raising animal TCM ingredient; Method: a High Performance Liquid Chromatography(HPLC) method was introduce for content determination, the column was Agilent C18(column length 250 mm, inner diameter 4.6 mm, packed particle diameter 5μm), with a mobile phase containing Ammonium acetate solution[0.15 mol/L Ammonium acetate-0.01 mol/L Disodium Edetate-Triethylamine(100:10:1), pH adjusted to 8.5 by acetic acid)-acetonitrile(83:17), the flowrate was 1.0 ml/min, the detection wavelength was 280 nm, the column temperature was 40℃ and the injection volume was 10μl; 10 batches of samples from 6 different origins were analyzed; Result: in 10 batches of samples, 4 batches from origin A had highest Doxycycline content, which was 2.111-2.364 mg/g; the one next to it was 1 batch from origin F, the value was 0.873 mg/g; the rest 5 batches from B, C, E, F had no significant difference,and the value was 0.003-0.013 mg/g. Conclusion: the method used in this work was fast, accurate and efficient, providing technical support to the investigation of antibiotic addition in raising Scorpio.

　　Keyword：　Scorpio; High Performance Liquid Chromatography; Doxycycline;

　　全蝎为《中国药典》收载的动物来源名贵药材，由于饲养环境特殊，为避免发生大规模病害、感染导致严重损失，部分养殖户可能在饲料中添加抗生素[1,2,3,4]。动物食用含抗生素的饲料后，体内残留的药物难以通过自然或人工方法清除，进而造成服用（包括外用）含全蝎类中药方剂的患者体内抗生素累积，影响患者身体健康。因此，目前对动物类药物、食品的质量控制研究中，常加入抗生素限量检查[5]。四环素类为广谱强效抗生素，文献报道显示，多种动物来源的药材、食品中，曾检出过上述药物。多西环素在四环素类抗生素中抗菌能力强，抗菌谱广，且较少报道过检出，因此具备一定的添加风险[6,7]。本研究拟收集多个产地多批全蝎样本，测定其中多西环素的含量，以研究该药物在动物来源药材饲养过程中的使用情况[8]。

　　1 、仪器和试药

　　1.1 、仪器

　　Agilent1200高效液相色谱仪，配备DAD检测器，自动进样器，四元高压泵和柱温箱（美国Agilent公司）；Mettler-Toledo电子天平（瑞士MettlerToledo公司）；ZW-800D全封闭智能匀浆仪（温州维科生物实验设备有限公司）；VM-D旋涡混合器（上海舍岩仪器有限公司）；Eppendorf 5506低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

　　1.2、 试剂、试药和材料

　　多西环素对照品（批号：130485-201703）购自中国食品药品检定研究院；样品处理用乙醇为分析纯，购自广州化学试剂厂；色谱分析用乙腈、乙酸铵、三乙胺等为色谱纯，购自Sigma-Alderich；实验用水为Watsons纯净水；全蝎药材购自各地中药店，采取匿名随机编码，产地编为A、B、C、D、E、F，每个产地所取批次分别编为001、002，以此类推。

　　2、 方法和结果

　　2.1 、对照品配制

　　取多西环素对照品，精密称取约5mg，置于5ml量瓶中，用50%乙醇溶液溶解后，继续加50%乙醇定容至刻度，即得每ml含多西环素1mg的溶液，作为对照品溶液。

　　2.2 、供试品溶液制备

　　取全蝎样本2g，精密称定，加0.01mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液匀浆后，转移至10ml量瓶中，再加入该溶液定容至10ml；吸取上述溶液1ml，置于另一10ml量瓶中，加50%乙醇稀释并定容至刻度，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。2.3含量测定方法色谱柱为Agilent C18(柱长250mm，柱内直径4.6mm,填料颗粒直径5μm);流动相为醋酸铵溶液[0.15mol/L醋酸铵溶液-0.01mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺(100:10:1),用醋酸调节pH值至8.5]-乙腈(83:17);流速1.0ml/min;检测波长为280nm;柱温40℃;进样量10μl；对照品和供试品色谱图见图1。

　　图1 对照品（50μg/ml）和供试品色谱图

　　2.4、 方法学考察

　　2.4.1、标准曲线和线性

　　取多西环素对照品溶液，精密吸取适量，置于多个5ml量瓶中，分别配制成浓度为1、5、10、20、50、100、200μg/ml的对照品溶液。吸取上述溶液，使用“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，进行线性回归，求得回归方程为y=11.995x+3.7306(x为多西环素浓度，y为峰面积，r=0.99990）。结果表明方法所测结果在1-200μg/ml的浓度范围内呈线性关系，能够准确测定供试品中多西环素的含量。

　　2.4.2、 精密度实验

　　取供试品溶液，连续按“2.3”项下方法测定6次，记录多西环素峰面积，计算峰面积的RSD，结果显示，多西环素峰面积的RSD为0.69%，参考现行版《中国药典》标准，符合相关规定，表明方法精密度良好。

　　2.4.3、重复性考察

　　取全蝎样品（均来自产地A），按“2.2”项下方法平行配制6份供试品溶液，再按“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，计算含量和含量的RSD，结果显示，多西环素含量的RSD为1.10%，参考现行版《中国药典》标准，符合相关规定，表明方法重复性良好。

　　2.4.4 、稳定性考察

　　取供试品溶液，置于自动进样器中，分别在放置后0、2、4、6、8、12小时按“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，计算含量和含量的RSD，结果显示，多西环素含量的RSD为1.00%，参考现行版《中国药典》标准，符合相关规定，表明方法所制备样品在12小时内稳定性良好。

　　2.4.5 、回收率试验

　　取全蝎样品（产地A)1g，精密加入多西环素对照品溶液适量（表1），平行配制6份溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，计算含量、回收率和回收率的RSD，结果显示，多西环素平均回收率为97.67%,RSD为1.76%，参考现行版《中国药典》标准，符合相关规定，表明方法准确度良好。

　　表1 回收率测定结果（n=6)

　　2.5 不、同产地全蝎多西环素含量测定

　　取全蝎样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下方法测定，记录多西环素峰面积，计算含量。10批样品中，来自产地A的4批多西环素含量最高，为2.111-2.364mg/g；其次为产地D的1批，含量0.873mg/g，其余B、C、E、F等地的5批无明显差异，含量在0.003-0.013mg/g之间（表2）。

　　表2 不同产地、批次多西环素含量测定结果（n=2)

　　3、 讨论

　　由不同产地多批次样品测定结果可知，全蝎在饲养过程中，不同程度存在抗生素添加。本研究所用方法虽然能够准确测定全蝎中添加的多西环素，但由于抗生素类药物种类繁多，很难在预先不了解药物添加种类的情况下，有针对性地进行相关检查和研究。为避免上述问题的出现，除继续加强信息收集和用药情况反馈外，可以使用更为精密和高灵敏度的仪器，如飞行时间质谱，通过将测定结果与化合物数据库信息进行比对和筛选，提高检测和限度检查的准确性。

　　参考文献

　　[1]杨志欣，汲丽丽,刘慧,卞杜嘉,许贵军,吕邵娃全蝎化学成分和药理作用的研究进展[J]中南药学,2020,18(09): 1523-1529.

　　[2]陈丽媛,王燕,王恬饲料中添加不同成分抗生素替代品对肉鸡生产性能和肠道健康的影响[J].饲料博览, 2020(02):1-5+9.

　　[3]宁尔渔业养殖环境中抗生素和汞的络合对汞形态变化的影响研究[D].浙江农林大学,2019.

　　[4]郭宏山.抗生素饲料添加剂在畜牧业生产中过度使用的危害及对策[J]南方农机,2019,50(02):73.

　　[5]周水清. Q-Orbitrap高分辨质谱用于检测中成药中非法添加的抗生素类和激素类药物[D].山东大学,2017.

　　[6]李晓蕊费小明汤郁，卢冰，杨元林，王丽霞多西环素上调H929骨髓瘤细胞PI3K/Akt信号通路的作用不利于其抗骨髓瘤效应[J].中国实验血液学杂志2020,28(05):1605-1610.

　　[7]刘月英头孢曲松、多西环素联合甲硝唑治疗盆腔炎[J]河南医学研究,2020,29(26):4903-4905.

　　[8]张青，,李慧素吴宁鹏，彭丽，吴志明鸡组织中多西环素残留量测定的高效液相色谱法建立[J]中国兽药杂志,2020,54(10):1-9.